Сплайсинг натриевых каналов в исследовании сердечной недостаточности (SOCS-HEFT)

Научная основа и значение

Введение:

Застойная сердечная недостаточность (ЗСН) представляет серьезную проблему здравоохранения в Соединенных Штатах. Было подсчитано, что около 5 миллионов пациентов в США страдают ХСН, и ежегодно у 550 000 человек диагностируется это заболевание.1 Известно, что внезапная сердечная смерть чаще возникает на фоне структурной болезни сердца. Более того, риск внезапной сердечной смерти в 6–9 раз выше у пациентов с сердечной недостаточностью, а сердечные аритмии, возможно, являются ведущей причиной смерти у пациентов с ХСН. 2,3 В настоящее время и Американский колледж кардиологов, и Американская кардиологическая ассоциация одобряют установку внутренних кардиовертеров-дефибрилляторов (ИКД) у пациентов с ишемической кардиомиопатией, приемлемой продолжительностью жизни и сниженной фракцией выброса ниже 40% (класс I, уровень доказательство A)4. Кроме того, установка ИКД рекомендуется пациентам с неишемической кардиомиопатией, которые соответствуют аналогичным требованиям с фракцией выброса менее 35% (класс I, уровень доказательности B)4. Несмотря на эти рекомендации по первичной профилактике внезапных смерть в результате имплантации ИКД, более чем у половины пациентов, получающих устройство, скорее всего, не возникнет аритмии, которая требует применения разряда ИКД.3 Устройства ИКД в среднем стоят 20-50 000 долларов США без учета операционных и последующих расходов. В настоящее время стратификация риска внезапной сердечной смерти и необходимость установки ИКД существенно зависят от оценки фракции выброса левого желудочка. Другими методами, используемыми для стратификации риска, являются электрокардиограмма с усреднением сигнала (ЭКГ) и другой электрокардиографический метод, известный как альтернация зубца Т. Хотя эти методы одобрены FDA для прогнозирования риска сердечной смерти, такие методы не получили широкого распространения в США из-за оборудования и затрат на персонал для их реализации. Таким образом, желательны альтернативные тесты для оценки риска развития внезапной сердечной смерти в популяции пациентов с сердечной недостаточностью.

Роль натриевых каналов и гена SCN5A:

Сердечный потенциалзависимый натриевый (Na+) канал, SCN5A, является основным каналом, генерирующим ток для распространения электрического тока в сердечной мышце, и является мишенью для многих антиаритмических препаратов. Дефектная экспрессия Na+-канала сердца приводит к повышенному риску аритмий, о чем свидетельствует внезапная смерть при синдроме Бругада5. Мутации SCN5A также связаны с наследственным синдромом удлиненного интервала QT, который может привести к развитию фатальных аритмий, таких как фибрилляция желудочков и желудочковая тахикардия типа «пируэт».6 Кроме того, предполагается существование мутаций в гене SCN5A, повышающих риск развития аритмий, вызванных приемом лекарств.7 Было проведено множество исследований, чтобы пролить свет на роль этого нечувствительного к тетродотоксину натриевого канала в болезненных состояниях. Было продемонстрировано, что мутированные натриевые каналы при дилатационной кардиомиопатии могут функционировать по-разному в зависимости от конкретного типа мутации основной альфа-субъединицы Na+-канала.8 В частности, Nguyen et al. продемонстрировали, что эти мутации могут приводить к изменениям физиологических функций, таким как более медленное время нарастания потенциала действия, усиленный поздний ток натрия в стационарном состоянии или нарушение инактивации.8 Дополнительные мутации в гене SCN5A были связаны со сдвигами в зависимости от напряжения инактивации Na+ каналов у пациентов с идиопатической фибрилляцией желудочков.9 Дополнительные исследования пришли к выводу, что снижение инактивации поздних натриевых токов может способствовать продлению потенциала действия.10 Было показано, что другая аномалия гена SCN5A, мутация E161K, приводит к снижению плотности тока натрия и положительному сдвигу на 11,9 мВ в полумаксимальном потенциале активации клеточной мембраны.11 Следовательно, мутации Na+-канала могут вызывать изменение поведения канала и аритмии.

Вальдивия и др. продемонстрировали, что пиковая плотность натриевого тока снижается на 39% в модели собак и примерно на 57% в эксплантированных отказавших человеческих сердцах, хотя механизм не ясен.10 Хотя наше понимание электрофизиологических изменений при сердечной недостаточности и их связи с аритмогенезом остается неясным, можно сделать вывод, что нарушения обработки натрия и, возможно, повышение уровня внутриклеточного натрия могут также приводить к изменению гомеостаза кальция посредством действия обменника Na+/Ca2+. 12,13 В целом такие изменения INa, вероятно, вносят значительный вклад в развитие аритмии в условиях недостаточности миокарда.

На уровне генома исследования были сосредоточены на роли мутаций гена SCN5A в аритмогенезе.8,9,14-16 Тем не менее, мы недавно описали приобретенные дефекты матричной РНК (мРНК) Na+-канала, которые приводят к уменьшению тока Na+ и возникают только при сердечной недостаточности. Три 3'-концевых варианта сплайсинга мРНК SCN5A были идентифицированы и охарактеризованы в желудочках сердца человека с недостаточностью. Было предсказано, что эти варианты сплайсинга приведут к трансляции нефункциональных каналов ионов натрия, в которых отсутствует соответствующая область пор домена IV. Эти три варианта сплайсинга продукта гена нефункционального натриевого канала были обозначены E28B, E28C и E28D. Относительные уровни полноразмерной изоформы мРНК Е28А были снижены на 24,7% у пациентов с ХСН по сравнению с контролем. Кроме того, две укороченные версии продукта гена были увеличены у пациентов с сердечной недостаточностью, что отражает приобретенную генетическую аномалию в продукции гена SCN5A при сердечной недостаточности. В то же время содержание мРНК E28C и E28D было увеличено в 14,2 и 3,8 раза соответственно у пациентов с ЗСН по сравнению с контрольной группой. Чтобы подтвердить, что варианты усечения могут способствовать риску аритмии, была создана модель мыши-гена-мишени с нонсенс-мутацией в экзоне 28. Также исследовали электрофизиологический эффект наличия этого укорочения гена. Было обнаружено, что скорость нарастания потенциала действия была снижена (p = 0,02, n=11), а амплитуда потенциала действия снизилась с 76 ± 1,4 мВ до 52 ± 0,6 мВ (p≤0,01, п=11). Интегральный эффект этого усечения был изучен путем изучения потенциалов биполярного поля (FP) кардиомиоцитов на микроэлектродных массивах.17 Наблюдалось снижение на 70,5% (p<0,05) с -1126 ± 314 мкВ (n = 6) в WT до 332 ± 174 мкВ (n = 7) в амплитуде FP. Дополнительные измерения, проведенные этим методом, выявили задержку роста FP и замедление скорости проводимости в мутантных клетках по сравнению с нормальным контролем, предполагая, что укороченные мутанты могут вызывать электрические аномалии, достаточно серьезные, чтобы способствовать риску аритмии. Также мы показали, что лимфоциты обрабатывают натриевые каналы аналогично кардиомиоцитам. Таким образом, процессинг мРНК лимфоцитов SCN5A может служить суррогатным маркером для оценки SCN5A на сердечном уровне и может коррелировать с риском аритмии в группах высокого риска. Это исследование будет оценивать это утверждение.

Конкретные цели/задачи:

Цель исследования 1:

Определить распространенность вариантов сплайсинга мРНК SCN5A у пациентов с ЗСН и исходной фракцией выброса менее 35% по сравнению с нормальным контролем аналогичных возрастных групп.

Цель исследования 2:

Сравнить распространенность вариантов сплайсинга мРНК SCN5A у пациентов с устройствами ИКД, которые подвергались и не подвергались шоковой терапии ИКД.

Исследовательские сайты производительности:

Медицинский центр Университета Иллинойса и Медицинский центр Джесси Брауна, штат Вирджиния.

Ключевой исследовательский персонал:

Главным исследователем этого исследования будет д. Сэмюэл Дадли, доктор медицинских наук. Доктор Дадли — заведующий отделением кардиологии Иллинойского университета в Чикаго. Он профессор медицины и автор публикаций в области сердечно-сосудистой медицины и физиологии.

Методы исследования:

Дизайн исследования:

Цель исследования 1: мы сопоставим количество вариантов сплайсинга Na+-каналов лейкоцитов с фракцией выброса у пациентов без сердечной недостаточности.

Цель исследования 2: мы сопоставим количество вариантов сплайсинга Na+-каналов лейкоцитов с количеством соответствующих разрядов ИКД у пациентов с установленными ИКД.

Исследовательские вмешательства:

Это исследование не требует изменения стандарта медицинской помощи. Все участники исследования будут подвергнуты флеботомии во время зачисления.

Сбор и обработка образцов:

Около 15 мл крови будет взято у участников исследования из Университета Иллинойса в Чикаго (UIC) или Медицинского центра по делам ветеранов Джесси Брауна (JBVAMC), которые дали информированное согласие на флеботомию и участие в исследовании. Образцы будут немедленно доставлены исследовательским персоналом (координатором, CO-PI и т. д.) в лабораторию доктора Дадли (PI) в комнате 1133 Здания клинических наук (CSB) для обработки в течение 2 часов после сбора. Будут измеряться уровни мРНК, и часть обработанного образца может храниться в морозильной камере при температуре -80 ° F в той же лаборатории на срок до 7 лет. Образцы НЕ будут храниться или обрабатываться в JBVAMC или любом другом учреждении.

Статистические соображения:

Взаимосвязь обилия вариантов мРНК Na+ канала будет сравниваться у субъектов с сердечной недостаточностью и без нее, а также у субъектов с событиями ИКД и без них. Первичной конечной точкой будет сравнение обилия вариантов мРНК. Зависимые переменные будут включать сердечную недостаточность для цели 1 и количество разрядов для цели 2. Количество пациентов, необходимое для каждой цели, определяется дисперсией теста, ожидаемой средней разницей и некоторым рассмотрением числа ковариат, которые потребуются. для анализа в регрессионном анализе. Ранее мы показали, что наименее чувствительной мерой было снижение численности E28A на 24%. Если мы предположим, что такое же процентное снижение произойдет в целях 1 и 2, то нам потребуется около 45 пациентов в каждой группе, чтобы иметь 90%-ную мощность для обнаружения этой разницы, предполагая 10%-й уровень потерь из-за технических ошибок в тестах. . Таким образом, нам потребуется в общей сложности 180 пациентов для всего исследования, 45 с сердечной недостаточностью, 45 контрольных, 45 пациентов с ИКД с явлениями и 45 пациентов без явлений.

Исходные данные будут выражены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD) для непрерывных переменных и частоты для категориальных переменных. Различия в исходных характеристиках между группами будут изучаться с использованием точного критерия Фишера и критерия Манна-Уитни для категориальных и непрерывных переменных соответственно. Поскольку количество зарегистрированных событий ICD является функцией времени наблюдения, регрессия Пуассона будет использоваться для моделирования любой взаимосвязи. В этой модели предполагается, что количество наблюдаемых событий ICD распределяется в соответствии с распределением Пуассона. То есть для данного периода времени вероятность того, что произошло определенное количество событий, является функцией частоты событий, умноженной на продолжительность наблюдения. Чтобы оценить влияние вариантов мРНК на скорость возникновения событий, предполагается, что частота событий является логарифмически линейной по отношению к интересующим предикторам. Решение этого уравнения дает коэффициенты частоты, сравнивающие частоту возникновения событий у субъектов с событиями ИКД и без них. Будут рассмотрены множественные выражения для обилия вариантов мРНК, такие как относительное обилие каждого варианта в отдельности, обилие отдельного варианта в зависимости от общего количества мРНК Na+-канала и отношение укорочений к полноразмерному Na+-каналу. мРНК. Коэффициент регрессии будет оцениваться для взаимосвязи между зависимой переменной, событиями ICD и независимыми переменными как логарифм оценок отношения скоростей. Статистическая значимость будет определяться с использованием теста отношения правдоподобия. Значение p, равное 0,05 или менее, считается статистически значимым. Результаты будут представлены в виде соотношения рисков и связанного с ним 95% доверительного интервала. Чтобы выбрать переменные для включения в модель, мы консервативно рассмотрим те переменные с различным распределением между двумя группами при p<0,20. Будет оценена возможность мультиколинеарности. Будут рассмотрены линейные и нелинейные условия. Нормальность распределений переменных будет проверяться графиком нормальной вероятности и тестом Шапиро-Уилка. Хотя регрессия достаточно терпима к нарушениям в этом отношении, преобразования будут исследоваться по мере необходимости. Гомоскедастичность будет оцениваться по графику остатков по сравнению с прогнозируемыми значениями. Дискриминация модели будет оцениваться по общему индексу C и подтверждаться методами начальной загрузки.

Ожидаемые результаты и подводные камни:

Мы не ожидаем каких-либо осложнений с получением образцов крови, анализом вариантов мРНК или выполнением статистики. Тем не менее, основным ограничением этого исследования является его ретроспективный характер. Тем не менее, эти данные будут полезны при планировании будущих проспективных испытаний.