Spleißen von Natriumkanälen in einer Studie zur Herzinsuffizienz (SOCS-HEFT)

Wissenschaftlicher Hintergrund und Bedeutung

Einführung:

Die dekompensierte Herzinsuffizienz (CHF) stellt in den Vereinigten Staaten ein Hauptanliegen im Gesundheitswesen dar. Es wurde geschätzt, dass etwa 5 Millionen Patienten in den USA an CHF leiden, und bei fast 550.000 Menschen wird diese Krankheit jährlich diagnostiziert.1 Es ist bekannt, dass der plötzliche Herztod häufiger im Rahmen einer strukturellen Herzerkrankung auftritt. Darüber hinaus ist das Risiko für einen plötzlichen Herztod in der Population mit Herzinsuffizienz 6- bis 9-mal größer, und Herzrhythmusstörungen sind möglicherweise die häufigste Todesursache bei CHF-Patienten. 2,3 Derzeit befürworten sowohl das American College of Cardiology als auch die American Heart Association die Platzierung interner Kardioverter-Defibrillatoren (ICDs) bei Patienten mit ischämischer Kardiomyopathie, angemessener Lebenserwartung und reduzierter Ejektionsfraktion unter 40 % (Klasse I, Stufe von Evidenz A).4 Darüber hinaus wird die Platzierung von ICDs bei Patienten mit nicht-ischämischer Kardiomyopathie empfohlen, die ähnliche Anforderungen mit einer Ejektionsfraktion von weniger als 35 % erfüllen (Klasse I, Evidenzgrad B).4 Trotz dieser Empfehlungen zur Primärprävention plötzlicher Tod durch ICD-Implantation, mehr als die Hälfte der Patienten, die ein Gerät erhalten, erleiden wahrscheinlich kein arrhythmisches Ereignis, das eine ICD-Schockabgabe erforderlich macht.3 ICD-Geräte kosten im Durchschnitt 20.000 bis 50.000 US-Dollar ohne Betriebs- und Folgekosten. Derzeit hängt die Risikostratifizierung des plötzlichen Herztods und der Notwendigkeit einer ICD-Platzierung im Wesentlichen von der Beurteilung der linksventrikulären Ejektionsfraktion ab. Andere Methoden zur Risikostratifizierung sind das signalgemittelte Elektrokardiogramm (EKG) und eine andere elektrokardiographische Technik, die als T-Wellen-Alternans bekannt ist. Obwohl diese Verfahren aufgrund der Risikovorhersage des Herztods von der FDA zugelassen sind, werden solche Techniken in den USA angesichts der Ausrüstungs- und Personalkosten für ihre Implementierung nicht weit verbreitet eingesetzt. Daher sind alternative Tests zur Risikobewertung für die Entwicklung eines plötzlichen Herztodes in der Population mit Herzinsuffizienz wünschenswert.

Rolle von Natriumkanälen und dem SCN5A-Gen:

Der kardiale spannungsgesteuerte Natriumkanal (Na+), SCN5A, ist der Hauptkanal, der Strom für die elektrische Ausbreitung im Herzmuskel erzeugt, und ist das Ziel vieler Antiarrhythmika. Eine fehlerhafte Expression des kardialen Na+-Kanals führt zu einem erhöhten Arrhythmierisiko, wie der plötzliche Tod beim Brugada-Syndrom zeigt.5 SCN5A-Mutationen wurden auch mit dem vererbten Long-QT-Syndrom in Verbindung gebracht, das zur Entwicklung tödlicher Rhythmusstörungen wie Kammerflimmern und Torsades de Pointes führen kann.6 Darüber hinaus wurde vorgeschlagen, dass Mutationen im SCN5A-Gen existieren und das Risiko für arzneimittelinduzierte Rhythmusstörungen erhöhen.7 Viele Studien wurden durchgeführt, um die Rolle dieses Tetrodotoxin-unempfindlichen Natriumkanals bei Krankheitszuständen zu beleuchten. Es wurde gezeigt, dass mutierte Natriumkanäle bei dilatativer Kardiomyopathie abhängig vom spezifischen Mutationstyp der Haupt-Alpha-Untereinheit des Na+-Kanals unterschiedlich funktionieren können.8 Insbesondere haben Nguyen et al. gezeigt, dass diese Mutationen zu Veränderungen in der physiologischen Funktion führen können, wie z. B. langsamere Anstiegszeit des Aktionspotentials, verstärkter später Natriumstrom im Steady-State oder beeinträchtigte Inaktivierung.8 Zusätzliche Mutationen im SCN5A-Gen wurden mit Verschiebungen in der Spannungsabhängigkeit der Na+-Kanalinaktivierung bei Patienten mit idiopathischem Kammerflimmern in Verbindung gebracht.9 Weitere Untersuchungen haben ergeben, dass eine verringerte Inaktivierung von späten Natriumströmen zur Verlängerung des Aktionspotentials beitragen kann.10 Eine andere Anomalie des SCN5A-Gens, die E161K-Mutation, führt nachweislich zu einer verringerten Natriumstromdichte und einer positiven Verschiebung um 11,9 mV im halbmaximalen Aktivierungspotential der Zellmembran.11 Daher können Mutationen des Na+-Kanals ein verändertes Kanalverhalten und Arrhythmien verursachen.

Valdiviaet al. zeigten, dass die maximale Natriumstromdichte im Hundemodell um 39 % und bei explantierten, versagenden menschlichen Herzen um etwa 57 % reduziert wird, obwohl der Mechanismus unklar ist.10 Obwohl unser Verständnis der elektrophysiologischen Veränderungen bei Herzinsuffizienz und ihrer Beziehung zur Arrhythmogenese unklar bleibt, kann gefolgert werden, dass Störungen im Umgang mit Natrium – und möglicherweise erhöhtes intrazelluläres Natrium – auch zu einer Veränderung der Kalziumhomöostase durch die Wirkung des Na+/Ca2+-Austauschers führen können. 12,13 Insgesamt tragen solche Änderungen von INa wahrscheinlich signifikant zur Arrhythmie bei Myokardinsuffizienz bei.

Auf Genomebene konzentrierte sich die Forschung auf die Rolle von SCN5A-Genmutationen bei der Arrhythmogenese.8,9,14-16 Dennoch haben wir kürzlich erworbene Defekte in der Boten-RNA (mRNA) des Na+-Kanals beschrieben, die zu einem reduzierten Na+-Strom führen und nur bei Herzinsuffizienz auftreten. Drei 3'-terminale SCN5A-mRNA-Spleißvarianten wurden in versagenden menschlichen Herzkammern identifiziert und charakterisiert. Es wurde vorhergesagt, dass diese Spleißvarianten zur Translation von nichtfunktionalen Natriumionenkanälen führen, denen eine geeignete Porenregion der Domäne IV fehlt. Diese drei Spleißvarianten für das nicht-funktionelle Natriumkanal-Genprodukt wurden als E28B, E28C und E28D bezeichnet. Die relativen Spiegel der Volllängen-mRNA-Isoform, E28A, waren bei Patienten mit CHF im Vergleich zur Kontrollgruppe um 24,7 % verringert. Darüber hinaus waren zwei verkürzte Versionen des Genprodukts bei Patienten mit Herzinsuffizienz erhöht, was eine erworbene genetische Anomalie bei der Produktion des SCN5A-Gens bei Herzinsuffizienz widerspiegelt. Gleichzeitig waren die E28C- und E28D-mRNA-Häufigkeiten bei CHF-Patienten im Vergleich zu Kontrollen um das 14,2-Fache bzw. 3,8-Fache erhöht. Um zu bestätigen, dass Trunkierungsvarianten zum Arrhythmierisiko beitragen könnten, wurde ein Gen-Target-Mausmodell mit einer Nonsense-Mutation an Exon 28 erstellt. Die elektrophysiologische Wirkung des Vorhandenseins dieser Genverkürzung wurde ebenfalls untersucht. Es wurde festgestellt, dass die Anstiegsrate des Aktionspotentials reduziert war (p = 0,02, n=11), und die Amplitude des Aktionspotentials wurde von 76 ± 1,4 mV auf 52 ± 0,6 mV (p≤0,01, n = 11). Der integrierte Effekt dieser Kürzung wurde durch Untersuchung der bipolaren Feldpotentiale (FP) von Kardiomyozyten auf Mikroelektrodenarrays untersucht.17 Es wurde eine 70,5 %ige Reduzierung (p < 0,05) von -1126 ± 314 μV (n = 6) im WT auf 332 ± 174 Mikro-V (n = 7) in der FP-Amplitude beobachtet. Zusätzliche Messungen, die mit dieser Methode durchgeführt wurden, zeigten eine Verzögerung des FP-Anstiegs und eine verlangsamte Leitungsgeschwindigkeit in den mutierten Zellen im Vergleich zu normalen Kontrollen, was darauf hindeutet, dass die Verkürzungsmutanten elektrische Anomalien verursachen könnten, die schwerwiegend genug sind, um zum Arrhythmierisiko beizutragen. Außerdem haben wir gezeigt, dass Lymphozyten Natriumkanäle ähnlich wie Kardiomyozyten verarbeiten. Daher kann die Lymphozyten-SCN5A-mRNA-Verarbeitung als Surrogatmarker dienen, um SCN5A auf kardialer Ebene zu beurteilen, und kann mit dem Arrhythmierisiko in Hochrisikopopulationen korrelieren. Diese Studie wird diese Behauptung bewerten.

Spezifische Ziele/Ziele:

Forschungsziel 1:

Bestimmung der Häufigkeit von SCN5A-mRNA-Splice-Varianten bei Patienten mit CHF und Ausgangs-Ejektionsfraktionen von weniger als 35 % im Vergleich zu normalen Kontrollen ähnlicher Altersgruppen.

Forschungsziel 2:

Um die Häufigkeit von SCN5A-mRNA-Spleißvarianten bei Patienten mit ICD-Geräten zu vergleichen, die eine ICD-Schocktherapie erhalten haben und die keine ICD-Schocktherapie erfahren haben.

Leistungsorte der Forschung:

University of Illinois Medical Center und Jesse Brown VA Medical Center.

Wichtiges Forschungspersonal:

Der leitende Prüfarzt für diese Studie wird Dr. Samuel Dudley, MD, PhD. Dr. Dudley ist Leiter der Abteilung für Kardiologie an der University of Illinois in Chicago. Er ist Professor für Medizin und veröffentlichter Autor auf dem Gebiet der kardiovaskulären Medizin und Physiologie.

Forschungsmethoden:

Studiendesign:

Forschungsziel 1: Wir werden die Menge an Spleißvarianten des Na+-Kanals der weißen Blutkörperchen mit der Ejektionsfraktion bei Patienten mit und ohne Herzinsuffizienz korrelieren.

Forschungsziel 2: Wir werden die Menge an Na+-Kanal-Splice-Varianten weißer Blutkörperchen mit der Anzahl angemessener ICD-Schocks bei Patienten mit eingesetztem ICD korrelieren.

Studieninterventionen:

Diese Studie erfordert keine Änderung des Behandlungsstandards. Alle Studienteilnehmer werden zum Zeitpunkt der Einschreibung einer Phlebotomie unterzogen.

Probenentnahme und -verarbeitung:

Etwa 15 ml Blut werden von Studienteilnehmern der University of Illinois at Chicago (UIC) oder des Jesse Brown Veterans Affairs Medical Center (JBVAMC) abgenommen, die ihre informierte Zustimmung zur Aderlass und Studienteilnahme gegeben haben. Die Proben werden umgehend vom Studienpersonal (Koordinator, CO-PI usw.) an das Labor von Dr. Dudley (PI) in Raum 1133 des Clinical Sciences Building (CSB) zur Verarbeitung innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme geliefert. Die mRNA-Spiegel werden gemessen, und ein Teil der verarbeiteten Probe kann bis zu 7 Jahre lang in einem -80 °F-Gefrierschrank im selben Labor gelagert werden. Proben werden NICHT bei JBVAMC oder einer anderen Einrichtung gelagert oder verarbeitet.

Statistische Überlegungen:

Das Verhältnis der Na+-Kanal-mRNA-Variantenhäufigkeiten wird bei Probanden mit und ohne Herzinsuffizienz und bei Probanden mit und ohne ICD-Ereignisse verglichen. Der primäre Endpunkt wird ein Vergleich der Häufigkeit von mRNA-Varianten sein. Zu den abhängigen Variablen gehören Herzinsuffizienz für Ziel 1 und die Anzahl der Schocks für Ziel 2. Die Anzahl der Patienten, die für jedes Ziel benötigt werden, wird durch die Varianz des Tests, die erwartete mittlere Differenz und einige Überlegungen zur Anzahl der erforderlichen Kovariaten bestimmt in der Regressionsanalyse analysiert werden. Zuvor haben wir gezeigt, dass das am wenigsten empfindliche Maß eine Verringerung der E28A-Häufigkeit um 24 % war. Wenn wir davon ausgehen, dass die gleiche prozentuale Reduktion bei den Zielen 1 und 2 eintritt, dann bräuchten wir etwa 45 Patienten in jeder Gruppe, um eine 90-prozentige Aussagekraft zu haben, um diesen Unterschied zu erkennen, unter der Annahme einer 10-prozentigen Verlustrate aufgrund technischer Fehler in den Assays . Daher würden wir insgesamt 180 Patienten für die gesamte Studie benötigen, 45 mit Herzinsuffizienz, 45 Kontrollen, 45 ICD-Patienten mit Ereignissen und 45 Patienten ohne Ereignisse.

Baseline-Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) für kontinuierliche Variablen und Häufigkeiten für kategoriale Variablen ausgedrückt. Unterschiede in den Ausgangsmerkmalen zwischen den Gruppen werden durch die Verwendung von exakten Fisher- und Mann-Whitney-Tests für kategoriale bzw. kontinuierliche Variablen untersucht. Da die Anzahl der aufgezeichneten ICD-Ereignisse eine Funktion der Beobachtungszeit ist, wird die Poisson-Regression verwendet, um jede Beziehung zu modellieren. In diesem Modell wird angenommen, dass die Anzahl der beobachteten ICD-Ereignisse gemäß einer Poisson-Verteilung verteilt ist. Das heißt, für einen bestimmten Zeitraum ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine bestimmte Anzahl von Ereignissen aufgetreten ist, eine Funktion der Ereignisrate multipliziert mit der Beobachtungsdauer. Um die Auswirkungen von mRNA-Varianten auf die Häufigkeit des Auftretens von Ereignissen abzuschätzen, wird angenommen, dass die Häufigkeit von Ereignissen in Bezug auf die interessierenden Prädiktoren log-linear ist. Das Lösen dieser Gleichung ergibt Ratenverhältnisse, die die Häufigkeit des Auftretens von Ereignissen bei Probanden mit und ohne ICD-Ereignisse vergleichen. Mehrere Ausdrücke für die mRNA-Variantenhäufigkeiten werden berücksichtigt, wie z. B. die relative Häufigkeit jeder einzelnen Variante, die Häufigkeit der einzelnen Variante als Funktion der gesamten Na+-Kanal-mRNA und das Verhältnis der Verkürzungen zum Na+-Kanal voller Länge mRNA. Der Regressionskoeffizient wird für die Beziehung zwischen der abhängigen Variablen, den ICD-Ereignissen und den unabhängigen Variablen als Logarithmus der Rate-Ratio-Schätzungen geschätzt. Die statistische Signifikanz wird unter Verwendung des Likelihood-Quotienten-Tests bestimmt. Ein p-Wert von 0,05 oder weniger wird als statistisch signifikant angesehen. Die Ergebnisse werden als Risikoverhältnis und das zugehörige 95 %-Konfidenzintervall angegeben. Um Variablen auszuwählen, die in das Modell aufgenommen werden sollen, werden wir konservativ diejenigen Variablen mit einer unterschiedlichen Verteilung zwischen den beiden Gruppen bei einem p < 0,20 berücksichtigen. Die Möglichkeit der Multikollinearität wird evaluiert. Lineare und nichtlineare Terme werden berücksichtigt. Die Normalverteilung der variablen Verteilungen wird durch ein Normalwahrscheinlichkeitsdiagramm und durch einen Shapiro-Wilk-Test getestet. Während die Regression in dieser Hinsicht recht tolerant gegenüber Verstößen ist, werden Transformationen nach Bedarf untersucht. Die Homoskedastizität wird anhand eines Diagramms der Residuen im Vergleich zu den vorhergesagten Werten bewertet. Die Diskrimination des Modells wird durch einen Gesamt-C-Index bewertet und durch Bootstrap-Methoden validiert.

Erwartete Ergebnisse und Fallstricke:

Wir erwarten keine Komplikationen bei der Entnahme von Blutproben, der Analyse von mRNA-Varianten oder der Durchführung der Statistik. Die größte Einschränkung dieser Studie ist jedoch ihr retrospektiver Charakter. Dennoch werden diese Daten bei der Gestaltung zukünftiger prospektiver Studien nützlich sein.