Splicing del canale del sodio nella prova dell'insufficienza cardiaca (SOCS-HEFT)

Sfondo scientifico e significato

Introduzione:

L'insufficienza cardiaca congestizia (CHF) rappresenta una delle principali preoccupazioni sanitarie negli Stati Uniti. È stato stimato che circa 5 milioni di pazienti negli Stati Uniti hanno CHF e quasi 550.000 persone ricevono questa malattia ogni anno.1 È noto che la morte cardiaca improvvisa si verifica più frequentemente nel contesto della cardiopatia strutturale. Inoltre, il rischio di morte cardiaca improvvisa è da 6 a 9 volte maggiore nella popolazione con scompenso cardiaco e le aritmie cardiache sono forse la principale causa di morte nei pazienti con CHF. 2,3 Attualmente, sia l'American College of Cardiology che l'American Heart Association approvano il posizionamento di defibrillatori cardioverter interni (ICD) in pazienti con cardiomiopatia ischemica, aspettativa di vita ragionevole e frazione di eiezione ridotta al di sotto del 40% (classe I, livello di evidenza A).4 Inoltre, il posizionamento di ICD è raccomandato nei pazienti con cardiomiopatia non ischemica che soddisfano requisiti simili con una frazione di eiezione inferiore al 35% (classe I, livello di evidenza B).4 Nonostante queste raccomandazioni per la prevenzione primaria delle morte per impianto di ICD, è probabile che più della metà dei pazienti che ricevono un dispositivo non sperimentino un evento aritmico che richieda l'erogazione di shock ICD.3 I dispositivi ICD, in media, costano $ 20-50.000 esclusi i costi operativi e di follow-up. Attualmente, la stratificazione del rischio di morte cardiaca improvvisa e la necessità di posizionamento dell'ICD dipendono essenzialmente dalla valutazione della frazione di eiezione ventricolare sinistra. Altri metodi impiegati per la stratificazione del rischio sono l'elettrocardiogramma mediato dal segnale (ECG) e un'altra tecnica elettrocardiografica nota come alternanza dell'onda T. Sebbene questi metodi siano approvati dalla FDA per la previsione del rischio di morte cardiaca, tali tecniche non sono ampiamente utilizzate negli Stati Uniti a causa dei costi delle attrezzature e del personale per implementarle. Pertanto, è auspicabile un test alternativo per la valutazione del rischio per lo sviluppo di morte cardiaca improvvisa nella popolazione con insufficienza cardiaca.

Ruolo dei canali del sodio e del gene SCN5A:

Il canale cardiaco voltaggio-dipendente del sodio (Na+), SCN5A, è il canale principale che genera corrente per la propagazione elettrica nel muscolo cardiaco ed è il bersaglio di molti farmaci antiaritmici. L'espressione difettosa del canale del Na+ cardiaco determina un aumento del rischio aritmico come evidenziato dalla morte improvvisa nella sindrome di Brugada.5 Le mutazioni SCN5A sono state anche implicate nella sindrome ereditaria del QT lungo, che può portare allo sviluppo di aritmie fatali come la fibrillazione ventricolare e le torsioni di punta.6 Inoltre, è stata anche proposta l'esistenza di mutazioni nel gene SCN5A che aumentano il rischio di aritmie indotte da farmaci.7 Sono stati condotti molti studi per far luce sul ruolo di questo canale del sodio insensibile alla tetrodotossina negli stati patologici. È stato dimostrato che i canali del sodio mutati nella cardiomiopatia dilatativa possono funzionare in modo diverso a seconda del tipo specifico di mutazione della principale subunità alfa del canale del Na+.8 Nello specifico, Nguyen et al. hanno dimostrato che queste mutazioni possono portare a cambiamenti nella funzione fisiologica come un tempo di aumento del potenziale d'azione più lento, un aumento della corrente di sodio tardiva durante lo stato stazionario o un'inattivazione compromessa.8 Ulteriori mutazioni nel gene SCN5A sono state collegate a cambiamenti nella dipendenza dal voltaggio dell'inattivazione del canale Na+ in pazienti con fibrillazione ventricolare idiopatica.9 Ulteriori ricerche hanno concluso che la ridotta inattivazione delle correnti tardive di sodio può contribuire al prolungamento del potenziale d'azione.10 È stato dimostrato che una diversa anomalia del gene SCN5A, la mutazione E161K, porta a una diminuzione della densità di corrente di sodio e a uno spostamento positivo di 11,9 mV nel potenziale di attivazione semimassimale della membrana cellulare.11 Pertanto, le mutazioni del canale Na+ possono causare alterazioni del comportamento del canale e aritmie.

Valdivia et al. ha dimostrato che la densità di picco della corrente di sodio è ridotta del 39% nel modello del cane e di circa il 57% nei cuori umani espiantati indeboliti, sebbene il meccanismo non sia chiaro.10 Sebbene la nostra comprensione dei cambiamenti elettrofisiologici nell'insufficienza cardiaca e la loro relazione con l'aritmogenesi rimanga poco chiara, si può dedurre che le interruzioni nella gestione del sodio - e forse l'aumento del sodio intracellulare - possono anche provocare cambiamenti nell'omeostasi del calcio attraverso l'azione dello scambiatore Na+/Ca2+. 12,13 Nel complesso, è probabile che tali cambiamenti nell'INa contribuiscano in modo significativo all'aritmia nel contesto di insufficienza miocardica.

A livello del genoma, la ricerca si è concentrata sul ruolo delle mutazioni del gene SCN5A nell'aritmogenesi.8,9,14-16 Tuttavia, abbiamo recentemente descritto difetti acquisiti nell'RNA messaggero del canale del Na+ (mRNA) che determinano una ridotta corrente di Na+ e si verificano solo nei cuori indeboliti. Tre varianti di splicing dell'mRNA SCN5A 3'-terminale sono state identificate e caratterizzate nei ventricoli del cuore umano in mancanza. Si prevedeva che queste varianti di giunzione portassero alla traduzione di canali ionici di sodio non funzionali privi di un'appropriata regione porosa del dominio IV. Queste tre varianti di splicing per il prodotto del gene del canale del sodio non funzionale sono state indicate con E28B, E28C ed E28D. I livelli relativi dell'isoforma di mRNA a lunghezza intera, E28A, sono diminuiti del 24,7% nei pazienti con CHF rispetto al controllo. Inoltre, due versioni troncate del prodotto genico sono state aumentate nei pazienti con insufficienza cardiaca, riflettendo un'anomalia genetica acquisita nella produzione del gene SCN5A nell'insufficienza cardiaca. Allo stesso tempo, le abbondanze di mRNA E28C ed E28D sono aumentate rispettivamente di 14,2 volte e 3,8 volte nei pazienti con CHF rispetto ai controlli. Per confermare che le varianti di troncamento potrebbero contribuire al rischio di aritmia, è stato creato un modello di topo gene-bersaglio con una mutazione senza senso nell'esone 28. È stato anche esaminato l'effetto elettrofisiologico della presenza di questo troncamento genico. È stato riscontrato che il tasso di aumento del potenziale d'azione era ridotto (p=0,02, n=11) e l'ampiezza del potenziale d'azione è stata ridotta da 76 ± 1,4 mV a 52 ± 0,6 mV (p≤0,01, n=11). L'effetto integrato di questo troncamento è stato studiato esaminando i potenziali di campo bipolare (FP) dei cardiomiociti su array di microelettrodi.17 È stata osservata una riduzione del 70,5% (p<0,05) da -1126 ± 314 μV (n=6) in WT a 332 ± 174 micro V (n=7) in ampiezza FP. Ulteriori misurazioni effettuate con questo metodo hanno rivelato un ritardo nell'aumento di FP e una velocità di conduzione rallentata nelle cellule mutanti rispetto ai controlli normali, suggerendo che i mutanti di troncamento potrebbero causare anomalie elettriche abbastanza gravi da contribuire al rischio aritmico. Inoltre, abbiamo dimostrato che i linfociti elaborano i canali del sodio in modo simile ai cardiomiociti. Pertanto, l'elaborazione dell'mRNA del linfocita SCN5A può fungere da marker surrogato per valutare SCN5A a livello cardiaco e può essere correlata al rischio aritmico nelle popolazioni ad alto rischio. Questo studio valuterà tale affermazione.

Finalità/obiettivi specifici:

Obiettivo della ricerca 1:

Per determinare l'abbondanza delle varianti di splicing dell'mRNA SCN5A in pazienti con CHF e frazioni di eiezione al basale inferiori al 35% rispetto ai controlli normali di gruppi di età simili.

Obiettivo della ricerca 2:

Per confrontare le abbondanze delle varianti di splicing dell'mRNA SCN5A in pazienti con dispositivi ICD che hanno e non hanno subito terapia d'urto ICD.

Prestazioni Siti di ricerca:

Centro medico dell'Università dell'Illinois e Jesse Brown VA Medical Center.

Personale di ricerca chiave:

Il Principal Investigator di questo studio sarà il Dott. Samuel Dudley, MD, PhD. Il dottor Dudley è il capo della sezione di cardiologia presso l'Università dell'Illinois a Chicago. È professore di medicina e autore di pubblicazioni nel campo della medicina cardiovascolare e della fisiologia.

Metodi di ricerca:

Disegno dello studio:

Obiettivo della ricerca 1: Correleremo la quantità di varianti di splicing del canale del Na+ dei globuli bianchi con la frazione di eiezione in pazienti senza scompenso cardiaco.

Obiettivo della ricerca 2: Correleremo la quantità di varianti di splicing del canale del Na+ dei globuli bianchi con il numero di shock ICD appropriati in pazienti con ICD in atto.

Interventi di studio:

Questo studio non richiede modifiche allo standard di cura. Tutti i partecipanti allo studio saranno sottoposti a flebotomia al momento dell'arruolamento.

Raccolta ed elaborazione dei campioni:

Circa 15 ml di sangue verranno prelevati dai partecipanti allo studio dell'Università dell'Illinois a Chicago (UIC) o del Jesse Brown Veterans Affairs Medical Center (JBVAMC) che hanno dato il consenso informato per la flebotomia e la partecipazione allo studio. I campioni verranno consegnati immediatamente dal personale dello studio (coordinatore, CO-PI, ecc.) al laboratorio del Dr. Dudley (PI) nella stanza 1133 del Clinical Sciences Building (CSB) per l'elaborazione entro 2 ore dalla raccolta. Verranno misurati i livelli di mRNA e parte del campione elaborato può essere conservato in un congelatore a -80 ° F nello stesso laboratorio per un massimo di 7 anni. I campioni NON verranno conservati o elaborati presso JBVAMC o qualsiasi altra struttura.

Considerazioni statistiche:

La relazione delle abbondanze delle varianti di mRNA del canale Na+ sarà confrontata in soggetti con e senza scompenso cardiaco e in soggetti con e senza eventi ICD. L'endpoint primario sarà il confronto delle abbondanze delle varianti di mRNA. Le variabili dipendenti includeranno l'insufficienza cardiaca per l'obiettivo 1 e il numero di shock per l'obiettivo 2. Il numero di pazienti necessari per ciascun obiettivo è determinato dalla varianza del test, dalla differenza media attesa e da alcune considerazioni sul numero di covariate che saranno necessarie da analizzare nell'analisi di regressione. In precedenza, abbiamo dimostrato che la misura meno sensibile era una riduzione dell'abbondanza di E28A del 24%. Se assumiamo che la stessa percentuale di riduzione si verificherà negli obiettivi 1 e 2, allora avremmo bisogno di circa 45 pazienti in ciascun gruppo per avere una potenza del 90% per rilevare questa differenza, ipotizzando un tasso di perdita del 10% dovuto a errori tecnici nelle analisi . Pertanto, avremmo bisogno di un totale di 180 pazienti per lo studio totale, 45 con insufficienza cardiaca, 45 controlli, 45 pazienti con ICD con eventi e 45 pazienti senza eventi.

I dati di riferimento saranno espressi come media ± deviazione standard (DS) per variabili continue e frequenze per variabili categoriali. Le differenze nelle caratteristiche di base tra i gruppi saranno esaminate mediante l'uso dei test esatti di Fisher e di Mann-Whitney rispettivamente per variabili categoriche e continue. Poiché il numero di eventi ICD registrati è una funzione del tempo di osservazione, verrà utilizzata la regressione di Poisson per modellare qualsiasi relazione. In questo modello, si presume che il numero di eventi ICD osservati sia distribuito seguendo una distribuzione di Poisson. Cioè, per un dato periodo di tempo, la probabilità che si sia verificato un certo numero di eventi è una funzione del tasso di eventi moltiplicato per la durata dell'osservazione. Per stimare gli effetti delle varianti di mRNA sul tasso di occorrenza dell'evento, si presume che il tasso di evento sia log lineare rispetto ai predittori di interesse. Risolvendo questa equazione si ottengono rapporti di frequenza che confrontano il tasso di occorrenza dell'evento in soggetti con e senza eventi ICD. Saranno prese in considerazione espressioni multiple per le abbondanze delle varianti di mRNA, come l'abbondanza relativa di ciascuna variante individualmente, l'abbondanza della variante individuale in funzione dell'mRNA del canale del Na+ totale e il rapporto tra i troncamenti e il canale del Na+ a lunghezza intera mRNA. Il coefficiente di regressione sarà stimato per la relazione tra la variabile dipendente, gli eventi ICD e le variabili indipendenti come logaritmo delle stime del rate ratio. La significatività statistica sarà determinata utilizzando il test del rapporto di verosimiglianza. Un valore p di 0,05 o meno sarà considerato statisticamente significativo. I risultati saranno riportati come rapporto di rischio e relativo intervallo di confidenza al 95%. Per selezionare le variabili da includere nel modello si considereranno, in via conservativa, quelle variabili con una diversa distribuzione tra i due gruppi a p<0.20. Verrà valutata la possibilità di multicolinearità. Verranno considerati termini lineari e non lineari. La normalità delle distribuzioni delle variabili sarà verificata mediante un normale plot di probabilità e mediante un test di Shapiro-Wilk. Sebbene la regressione sia abbastanza tollerante nei confronti delle violazioni in questo senso, le trasformazioni saranno esaminate se necessario. L'omoscedasticità sarà valutata mediante il grafico dei residui rispetto ai valori previsti. La discriminazione del modello sarà valutata mediante un indice C complessivo e validata mediante metodi bootstrap.

Risultati previsti e insidie:

Non prevediamo alcuna complicazione con l'acquisizione di campioni di sangue, l'analisi delle varianti di mRNA o l'esecuzione delle statistiche. Tuttavia, il limite principale di questo processo è la sua natura retrospettiva. Tuttavia, questi dati saranno utili nella progettazione di futuri studi prospettici.