Estresse Oxidativo e Função Endotelial em Complicações da Gravidez (ENDOPREG)

INTRODUÇÃO. Na gravidez normal, ocorre a remodelação vascular das artérias espirais uterinas maternas. As células trofoblásticas invadem as arteríolas espirais nas primeiras 12 semanas de gestação e substituem a parede muscular dos vasos, convertendo-os em vasos de calibre largo, baixa resistência e grande capacidade, processo normalmente concluído na 20ª semana de gestação. A patogênese da disfunção endotelial generalizada em gestações complicadas é subdividida em duas fases. A primeira fase existe de uma pobre invasão trofoblástica das artérias espirais durante o processo de placentação, causando falha na transformação das artérias do leito placentário de vasos de alta para baixa resistência. Isso resulta em isquemia local, dano de reperfusão e estresse oxidativo. O dano local ativa a segunda fase, onde a produção aumentada de fatores antiangiogênicos e produtos de estresse oxidativo resulta em inflamação sistêmica, ativação endotelial e diminuição do óxido nítrico endotelial. Caso o dano endotelial seja mais evidente, a microangiopatia trombótica é induzida com trombos de plaquetas-fibrina em microvasos. A angiopatia resulta no consumo de plaquetas circulantes, causa hemólise nos microvasos afetados e reduz o fluxo sanguíneo portal no fígado, resultando finalmente em necrose periportal, condição observada na pré-eclâmpsia (PE) grave.

HIPÓTESE.

• O aumento do estresse oxidativo e a disfunção endotelial estão presentes no início da gravidez, quando as complicações da gravidez se desenvolverão mais tarde.
• O estresse oxidativo e a disfunção endotelial não são totalmente independentes um do outro e podem ser medidos.
• O estresse oxidativo pode ser reduzido e a função endotelial pode ser melhorada por intervenções que reduzirão o risco de desenvolver complicações na gravidez.

Assim: a medição e integração em um algoritmo de estresse oxidativo e função endotelial no início da gravidez nos permitirá determinar quais gestações se beneficiarão de intervenções preventivas. Essa seleção otimizará as intervenções direcionadas em gestações de alto risco sem tratamento excessivo de outras.

METODOLOGIA

1. Desenho do estudo 1.1. Estudo longitudinal prospectivo de centro único Para a primeira parte do estudo, os investigadores propõem um desenho longitudinal prospectivo. As mulheres grávidas no primeiro trimestre de gravidez serão elegíveis e serão acompanhadas durante toda a gravidez e até 6 meses após o parto.

   1.2. Estudo de caso-controle multicêntrico pareado A segunda parte é um estudo de caso-controle onde pacientes com gestações complicadas por HIP/EP/prematuridade/RCIU serão comparadas a controles normotensos, pareados por idade materna e gestacional, paridade, tabagismo, IMC e etnia grupo. As pacientes serão acompanhadas durante (o resto de sua) gravidez e até 6 meses após o parto. Os pacientes neste estudo serão incluídos em UZA, Erasmus MC, Maastricht UMC, ZOL (Ziekenhuis Oost-Limburg).

2. Descrição das investigações 2.1 Função endotelial (RHI): O índice de hiperemia reativa é medido por tonometria arterial periférica (PAT) (endoPAT®, Itamar). O tonômetro consiste em um pletismógrafo de sonda montado no dedo, capaz de detectar alterações de volume nos vasos dos dedos indicadores. É uma técnica não dependente do operador e, portanto, reprodutível. Os sensores são colocados na ponta dos dedos dos dedos indicadores.

A oclusão suprassistólica do braço não dominante, a 200 mmHg ou 60 mmHg acima da pressão arterial sistólica, será obtida com o uso de um manguito. Após a oclusão do braço, a resposta à hiperemia reativa será medida. O braço contralateral (dominante) é usado como controle, para corrigir os efeitos sistêmicos.

2.2 Rigidez arterial (PWV, PWA): A velocidade da onda de pulso e a análise da onda de pulso serão calculadas usando o sistema Sphygmocor ® (Atcor Medical, West Ryde, Austrália). Para calcular a PWV, duas formas de onda de pressão devem ser medidas a uma distância conhecida e a distância entre os locais de medição é dividida pelo tempo de propagação. A PWV aórtica é medida pela PWV carotídeo-femoral (cfPWV), pois é a medida "padrão ouro" da rigidez da aorta. As medições de cfPWV serão realizadas usando um tonômetro de pressão para registrar transcutaneamente a forma de onda de pulso de pressão na artéria subjacente. O tonômetro contém um micromanômetro que fornece um registro muito preciso da pressão dentro da artéria. A VOP carótida e femoral será avaliada comprimindo suavemente, respectivamente, a artéria carótida e a artéria femoral com a ponta do tonômetro no local de pulsação máxima. O dispositivo Sphygmocor calculará automaticamente o cfPWV. O PWA calculará AIx colocando o tonômetro na artéria radial (local de pulsação máxima). Uma função de transferência generalizada derivará a forma de onda da pressão aórtica a partir da forma de onda da artéria radial. A partir da forma de onda da pressão aórtica, a pressão de aumento (AP) e o índice de aumento (AIx) podem ser calculados. O AP (ΔP) é definido como a altura do pico sistólico tardio acima do ponto de inflexão na forma de onda. A AIx é definida como a PA expressa em porcentagem da PP aórtica. Como o AIx é afetado pela frequência cardíaca, ele será padronizado para uma frequência cardíaca de 75 bmp (AIx-75).

2.3 Índice de pulsatilidade da artéria uterina (PI UA) e biometria fetal: Os exames de Doppler da artéria uterina serão realizados usando Doppler de onda pulsada dirigida colorida trans-abdominal (Voluson, GE Healthcare Technologies, EUA). O IP de ambas as artérias uterinas será obtido em ambos os lados do colo do útero antes de 14 semanas de gestação e no cruzamento aparente com as artérias ilíacas externas após 14 semanas. No mesmo momento serão medidos os parâmetros básicos da biometria fetal: diâmetro biparietal, perímetro cefálico, perímetro abdominal, comprimento do fêmur e peso fetal esperado pela fórmula de Hadlocks.

2.4 NLR e MPV: Realizando um hemograma completo, NLR, MPV e contagem de plaquetas serão obtidos usando um Sistema de Hematologia ADVIA 120 (Siemens Healthcare, Alemanha).

2.5 Medição automatizada da pressão arterial: PAS (pressão arterial sistólica), PAD (pressão arterial diastólica) e MAP (pressão arterial média) após 10 minutos de repouso na posição sentada, serão medidos usando um monitor Mindray VS 900 (Mindray, China).

2.6 Estresse oxidativo 2.6.1 Ressonância paramagnética eletrônica: NO e O2∙- EPR (ressonância paramagnética eletrônica) é derivada da espectroscopia de ressonância magnética e usa radiação de micro-ondas para detectar moléculas com um número de elétrons desemparelhado, como radicais. Quando um campo magnético é criado pelo espectrômetro EPR, todos os radicais se alinham. O espectrômetro EPR envia uma micro-ondas frequente, fazendo com que os elétrons saltem de um estado de energia baixo para um alto. Essa absorção de energia pode ser medida e está diretamente correlacionada com a quantidade de radicais livres na amostra. Uma 'spin trap' será adicionada para eliminar os radicais muito reativos e prolongar sua meia-vida. A concentração de NO será determinada utilizando uma solução de Ferro-DETC (Fe(II)DETC2 (ferro(II)dietilditiocarbamaat). A sonda spin para determinação de O2∙- (superóxido) no soro materno é CMH (1-Hidroxi-3-metoxicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina) e no tecido placentário é o ácido ascórbico (Vitamina C). A vitamina C tem um efeito antioxidante e está presente em abundância no corpo humano. O2∙- reage facilmente com a vitamina C para formar o radical ascórbico. Este radical ascórbico é uma medida da concentração de O2∙- no tecido placentário. O tecido placentário será investigado no momento do parto, soro materno na semana 9, semana 28, no parto e 6 meses pós-parto.

2.6.2 Análise de Western blot: ONOO-, eNOS en iNOS NO e O2∙- reagem para formar ONOO-. A produção de ONOO- será medida indiretamente no tecido placentário via nitração de tirosina. A nitrotirosina surge quando ONOO- reage com tirosina em proteínas e pode ser quantificada no tecido placentário com Western blotting usando anticorpos anti-nitrotirosina. O NO é formado a partir da L-Arginina pela NOS (Óxido Nítrico Sintase). Essa reação é regulada pelo VEGF (Vascular endothelial growth factor), um mitógeno endotelial que tem função importante na proliferação de células endoteliais e na angiogênese. O VEGF estimula a eNOS (NOS endotelial) e, portanto, induz a produção de NO. A isquemia placentária aumentará a produção de VEGF e, assim, aumentará a produção de NO, como um mecanismo compensatório para garantir transfusão feto-materna suficiente. Em um ambiente oxidativo, a falta de fatores estabilizadores de NOS resulta no desacoplamento de NOS. O acoplamento NOS causa uma mudança da produção de NO para a produção de O2∙. Isso mantém uma configuração oxidativa. A produção de iNOS (NOS induzível) é induzida por citocinas e endotoxinas durante condições inflamatórias. Os anticorpos monoclonais determinarão as concentrações de eNOS e iNOS no tecido placentário.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

1. Cálculo do tamanho da amostra 1.1. Estudo longitudinal prospectivo de centro único Para o estudo fisiológico do RHI na gravidez, os investigadores calcularam que, para um intervalo de confiança de 95%, um desvio padrão populacional de 0,5 (conforme descrito em outras populações para RHI) e um erro padrão tolerável da média (SEM ) de 0,1, 97 mulheres devem ser acompanhadas. Considerando pelo menos 10% de abandono, o tamanho da amostra inicial será de 110 mulheres.

   1.2. Estudo de caso-controle multicêntrico pareado Em um estudo piloto de Yinon [Yinon, 2006] o índice de hiperemia reativa (RHI) em gestações normotensas foi de 1,8 e em PE de 1,5; na maioria das populações, o desvio padrão é de 0,5. Para um poder de 80% e um α bilateral = 0,05 e considerando uma diferença de 0,3 clinicamente relevante, o tamanho da amostra para cada grupo seria 44; que será considerado o tamanho da amostra para o estudo transversal comparando PE (44), PIH (44), RCIU (44) e parto prematuro (44) com controles normotensos (44).

2. Estatística descritiva e análise de dados 2.1. Estudo longitudinal prospectivo de centro único Para o estudo fisiológico do RHI na gravidez, os investigadores calcularão os valores de referência e o intervalo de confiança de 95%. Dados longitudinais serão plotados e um modelo linear de efeitos mistos com interceptação aleatória será ajustado. Os percentis para RHI e PWV serão calculados com base neste modelo. Coeficientes de correlação entre RHI basal, PWV, AI Doppler PI, biometria fetal, NLR, MPV, MAP, percentil de peso ao nascer e EDCs serão analisados.

2.2. Estudo de caso-controle multicêntrico pareado RHI, PWV, AI Doppler PI, biometria fetal, NLR, MPV, MAP, peso ao nascer e EDCs e outras variáveis ​​contínuas em gestações hipertensas versus não hipertensas serão testadas quanto à normalidade usando o Shapiro Wilk Test. Se houver normalidade, serão expressos em média, desvio padrão e intervalo de confiança de 95% e comparados por meio do teste T bilateral. Caso contrário, eles serão expressos como mediana e intervalos interquartis e comparados usando o Teste U de Mann Whitney.