Stress ossidativo e funzione endoteliale nelle complicanze della gravidanza (ENDOPREG)

INTRODUZIONE. Nella gravidanza normale si verifica il rimodellamento vascolare delle arterie spirali uterine materne. Le cellule del trofoblasto invadono le arteriole a spirale entro le prime 12 settimane di gravidanza e sostituiscono la parete muscolare dei vasi convertendoli in vasi di grande diametro, a bassa resistenza e di grande capacità, un processo normalmente completato entro la 20a settimana di gestazione. La patogenesi della disfunzione endoteliale generalizzata nelle gravidanze complicate è suddivisa in due fasi. Esiste la prima fase di una scarsa invasione del trofoblasto delle arterie a spirale durante il processo di placentazione, che causa l'incapacità di trasformare le arterie del letto placentare da vasi ad alta a bassa resistenza. Ciò si traduce in ischemia locale, danno da riperfusione e stress ossidativo. Il danno locale attiva la seconda fase in cui una maggiore produzione di fattori anti-angiogenici e prodotti dello stress ossidativo provoca infiammazione sistemica, attivazione endoteliale e diminuzione dell'ossido nitrico endoteliale. Nel caso in cui il danno endoteliale sia più evidente, viene indotta una microangiopatia trombotica con trombi di fibrina piastrinica nei microvasi. L'angiopatia provoca il consumo di piastrine circolanti, provoca emolisi nei microvasi interessati e riduce il flusso sanguigno portale nel fegato, provocando infine la necrosi periportale, una condizione osservata nella grave preeclampsia (EP).

IPOTESI.

• L'aumento dello stress ossidativo e della disfunzione endoteliale sono presenti all'inizio della gravidanza, quando in seguito si svilupperanno complicanze della gravidanza.
• Lo stress ossidativo e la disfunzione endoteliale non sono del tutto indipendenti l'uno dall'altro e possono essere misurati.
• Lo stress ossidativo può essere ridotto e la funzione endoteliale può essere migliorata mediante interventi che ridurranno il rischio di sviluppare complicanze della gravidanza.

Pertanto: la misurazione e l'integrazione in un algoritmo dello stress ossidativo e della funzione endoteliale all'inizio della gravidanza ci consentirà di determinare quali gravidanze beneficeranno di interventi preventivi. Questa selezione ottimizzerà gli interventi mirati sulle gravidanze ad alto rischio senza sovratrattamento degli altri.

METODOLOGIA

1. Disegno dello studio 1.1. Studio longitudinale prospettico a centro singolo Per la prima parte dello studio, i ricercatori propongono un disegno longitudinale prospettico. Le donne incinte nel loro primo trimestre di gravidanza, saranno idonee e saranno seguite per tutta la gravidanza e fino a 6 mesi dopo il parto.

   1.2. Studio caso-controllo abbinato multicentrico La seconda parte è uno studio caso-controllo in cui le pazienti con gravidanze complicate da PIH/EP/parto pretermine/IUGR saranno confrontate con controlli normotesi, abbinate per età materna e gestazionale, parità, comportamento al fumo, BMI ed etnia gruppo. I pazienti saranno seguiti durante (il resto della loro) gravidanza e fino a 6 mesi dopo il parto. I pazienti in questo studio saranno inclusi in UZA, Erasmus MC, Maastricht UMC, ZOL (Ziekenhuis Oost-Limburg).

2. Descrizione delle indagini 2.1 Funzione endoteliale (RHI): L'indice di iperemia reattiva viene misurato utilizzando la tonometria dell'arteria periferica (PAT) (endoPAT®, Itamar). Il tonometro è costituito da un pletismografo a sonda montato sul dito, in grado di rilevare le variazioni di volume nei vasi degli indici. È una tecnica non operatore-dipendente e quindi riproducibile. I sensori sono posizionati sulla punta delle dita degli indici.

L'occlusione soprasistolica della parte superiore del braccio non dominante, a 200 mmHg o 60 mmHg sopra la pressione arteriosa sistolica, sarà ottenuta utilizzando un bracciale. Dopo l'occlusione della parte superiore del braccio verrà misurata la risposta all'iperemia reattiva. Il braccio controlaterale (dominante) viene utilizzato come controllo, per correggere gli effetti sistemici.

2.2 Rigidità arteriosa (PWV, PWA): la velocità dell'onda del polso e l'analisi dell'onda del polso saranno calcolate utilizzando il sistema Sphygmocor® (Atcor Medical, West Ryde, Australia). Per calcolare PWV, due forme d'onda di pressione devono essere misurate a una distanza nota e la distanza tra i siti di misurazione è divisa per il tempo di propagazione. La PWV aortica è misurata dalla PWV carotido-femorale (cfPWV) in quanto è la misurazione "gold standard" della rigidità dell'aorta. Le misurazioni di cfPWV saranno eseguite utilizzando un tonometro a pressione per registrare transcutaneamente la forma d'onda del polso di pressione nell'arteria sottostante. Il tonometro contiene un micromanometro che fornisce una registrazione molto accurata della pressione all'interno dell'arteria. La PWV carotidea e femorale sarà valutata comprimendo delicatamente rispettivamente l'arteria carotide e l'arteria femorale con la punta del tonometro nel sito di massima pulsazione. Il dispositivo Sphygmocor calcolerà automaticamente il cfPWV. PWA calcolerà AIx posizionando il tonometro sull'arteria radiale (sito di massima pulsazione). Una funzione di trasferimento generalizzata deriverà la forma d'onda della pressione aortica dalla forma d'onda dell'arteria radiale. Dalla forma d'onda della pressione aortica, è possibile calcolare la pressione di aumento (AP) e l'indice di aumento (AIx). L'AP (ΔP) è definito come l'altezza del picco sistolico tardivo al di sopra del punto di flesso sulla forma d'onda. L'AIx è definito come AP espresso come percentuale del PP aortico. Poiché AIx è influenzato dalla frequenza cardiaca, sarà standardizzato a una frequenza cardiaca di 75 bmp (AIx-75).

2.3 Indice di pulsatilità dell'arteria uterina (PI UA) e biometria fetale: gli esami Doppler dell'arteria uterina saranno eseguiti utilizzando Doppler a onde pulsate a colori transaddominali (Voluson, GE Healthcare Technologies, USA). Il PI di entrambe le arterie uterine sarà ottenuto su entrambi i lati della cervice prima della gestazione di 14 settimane e all'apparente crossover con le arterie iliache esterne dopo 14 settimane. Contemporaneamente verranno misurati i parametri di base della biometria fetale: diametro bi-parietale, circonferenza cranica, circonferenza addominale, lunghezza del femore e peso fetale atteso utilizzando la formula di Hadlocks.

2.4 NLR e MPV: L'esecuzione di un emocromo completo, NLR, MPV e conta piastrinica sarà ottenuta utilizzando un sistema ematologico ADVIA 120 (Siemens healthcare, Germania).

2.5 Misurazione automatica della pressione arteriosa: SBP (pressione arteriosa sistolica), DBP (pressione arteriosa diastolica) e MAP (pressione arteriosa media) dopo 10 minuti di riposo in posizione seduta, saranno misurati utilizzando un monitor Mindray VS 900 (Mindray, Cina).

2.6 Stress ossidativo 2.6.1 Risonanza paramagnetica elettronica: NO e O2∙- EPR (risonanza paramagnetica elettronica) deriva dalla spettroscopia di risonanza magnetica e utilizza la radiazione a microonde per rilevare molecole con un numero di elettroni spaiato, come i radicali. Quando un campo magnetico viene creato dallo spettrometro EPR, tutti i radicali si allineeranno. Lo spettrometro EPR emette un microonde radiofrequente, facendo saltare gli elettroni da uno stato di energia bassa a uno stato di alta energia. Questo assorbimento di energia può essere misurato ed è direttamente correlato alla quantità di radicali liberi nel campione. Verrà aggiunta una 'trappola di spin' per eliminare i radicali molto reattivi e per prolungare la loro vita dimezzata. La concentrazione di NO sarà determinata usando una soluzione di Ferro-DETC (Fe(II)DETC2 (ferro(II)dietilditiocarbammato). Lo spin probe per la determinazione di O2∙- (superossido) nel siero materno è il CMH (1-idrossi-3-metossicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina) e nel tessuto placentare è l'acido ascorbico (vitamina C). La vitamina C ha un effetto antiossidante ed è abbondantemente presente nel corpo umano. O2∙- reagisce facilmente con la vitamina C per formare il radicale ascorbico. Questo radicale ascorbico è una misura della concentrazione di O2∙ nel tessuto placentare. Il tessuto placentare sarà esaminato al momento del parto, il siero materno alla settimana 9, alla settimana 28, al parto e 6 mesi dopo il parto.

2.6.2 Analisi Western blot: ONOO-, eNOS en iNOS NO e O2∙- reagiscono formando ONOO-. La produzione di ONOO- sarà misurata indirettamente nel tessuto placentare tramite nitrazione di tirosina. La nitrotirosina si forma quando ONOO- reagisce con la tirosina nelle proteine ​​e può essere quantificata nel tessuto placentare con Western blotting utilizzando anticorpi anti-nitrotirosina. NO è formato da L-arginina da NOS (ossido nitrico sintasi). Questa reazione è regolata dal VEGF (Vascular endothelial growth factor), un mitogeno endoteliale che ha un'importante funzione nella proliferazione delle cellule endoteliali e nell'angiogenesi. Il VEGF stimola la eNOS (endothelial NOS) e quindi induce la produzione di NO. L'ischemia placentare aumenterà la produzione di VEGF e quindi aumenterà la produzione di NO, come meccanismo compensatorio per garantire una sufficiente trasfusione feto-materna. In un ambiente ossidativo, la mancanza di fattori stabilizzanti NOS provoca il disaccoppiamento NOS. L'accoppiamento NOS provoca uno spostamento dalla produzione di NO alla produzione di O2∙. Questo mantiene un ambiente ossidativo. La produzione di iNOS (inducible NOS) è indotta da citochine ed endotossine durante condizioni infiammatorie. Gli anticorpi monoclonali determineranno le concentrazioni di eNOS e iNOS nel tessuto placentare.

ANALISI STATISTICA

1. Calcolo della dimensione del campione 1.1. Studio longitudinale prospettico a centro singolo Per lo studio fisiologico del RHI in gravidanza, i ricercatori hanno calcolato che per un intervallo di confidenza del 95%, una deviazione standard della popolazione di 0,5 (come descritto in altre popolazioni per RHI) e un errore standard tollerabile della media (SEM ) valore di 0,1, devono essere seguite 97 donne. Tenendo conto di almeno un abbandono del 10%, la dimensione del campione iniziale sarà di 110 donne.

   1.2. Studio caso-controllo multicentrico abbinato In uno studio pilota di Yinon [Yinon, 2006] l'indice di iperemia reattiva (RHI) nelle gravidanze normotensive era 1,8 e nell'EP 1,5; nella maggior parte delle popolazioni la deviazione standard è 0,5. Per una potenza dell'80% e un α bilaterale = 0,05 e considerando una differenza di 0,3 clinicamente rilevante, la dimensione del campione per ciascun gruppo sarebbe 44; che sarà considerata la dimensione del campione per lo studio trasversale che confronta PE (44), PIH (44), IUGR (44) e nascita pretermine (44) con controlli normotesi (44).

2. Statistica descrittiva e analisi dei dati 2.1. Studio longitudinale prospettico a centro singolo Per lo studio fisiologico dell'RHI in gravidanza, i ricercatori calcoleranno i valori di riferimento e l'intervallo di confidenza al 95%. Verranno tracciati i dati longitudinali e verrà adattato un modello lineare a effetti misti con intercetta casuale. I percentili per RHI e PWV saranno calcolati sulla base di questo modello. Saranno analizzati i coefficienti di correlazione tra RHI basale, PWV, UA Doppler PI, biometria fetale, NLR, MPV, MAP, percentile del peso alla nascita e EDC.

2.2. Studio caso-controllo abbinato multicentrico RHI, PWV, UA Doppler PI, biometria fetale, NLR, MPV, MAP, peso alla nascita e EDC e altre variabili continue nelle gravidanze ipertese rispetto a quelle non ipertensive saranno testate per la normalità utilizzando lo Shapiro Wilk Test. Se c'è normalità, saranno espressi come media, deviazioni standard e intervalli di confidenza al 95% e confrontati utilizzando il test T a due code. In caso contrario, saranno espressi come intervalli mediani e interquartili e confrontati utilizzando il test U di Mann Whitney.