Oxidační stres a funkce endotelu u komplikací těhotenství (ENDOPREG)

ÚVOD. V normálním těhotenství dochází k cévní remodelaci mateřských děložních spirálních tepen. Trofoblastové buňky napadají spirální arterioly během prvních 12 týdnů těhotenství a nahrazují svalovou stěnu cév a přeměňují je na velkokapacitní cévy se širokým otvorem a nízkou odolností, což je proces normálně dokončený do 20. týdne těhotenství. Patogeneze generalizované endoteliální dysfunkce u komplikovaných těhotenství je rozdělena do dvou fází. První fáze je slabá invaze trofoblastů do spirálních arterií během procesu placenty, což způsobuje selhání transformace arterií placentárního lůžka z cév s vysokým odporem na cévy s nízkou rezistencí. To má za následek lokální ischemii, reperfuzní poškození a oxidační stres. Lokální poškození aktivuje druhou fázi, kdy zvýšená produkce antiangiogenních faktorů a produktů oxidačního stresu vede k systémovému zánětu, aktivaci endotelu a snížení endoteliálního oxidu dusnatého. V případě, že je endoteliální poškození nejvýraznější, je trombotická mikroangiopatie indukována tromby trombocytů a fibrinu v mikrocévách. Angiopatie vede ke spotřebě cirkulujících krevních destiček, způsobuje hemolýzu v postižených mikrocévách a snižuje portální průtok krve v játrech, což nakonec vede k periportální nekróze, což je stav pozorovaný u těžké preeklampsie (PE).

HYPOTÉZA.

• Zvýšený oxidační stres a endoteliální dysfunkce jsou přítomny na začátku těhotenství, kdy se později rozvinou těhotenské komplikace.
• Oxidační stres a endoteliální dysfunkce nejsou na sobě zcela nezávislé a lze je měřit.
• Oxidační stres lze snížit a endoteliální funkci zlepšit intervencemi, které sníží riziko rozvoje těhotenských komplikací.

Takže: měření a integrace do algoritmu oxidačního stresu a endoteliální funkce v časném těhotenství nám umožní určit, která těhotenství budou mít prospěch z preventivních intervencí. Tento výběr bude optimalizovat cílené intervence u vysoce rizikových těhotenství bez přeléčení ostatních.

METODOLOGIE

1. Návrh studie 1.1. Jednocentrová prospektivní longitudinální studie Pro první část studie navrhli výzkumníci prospektivní longitudinální design. Těhotné ženy v prvním trimestru těhotenství budou způsobilé a budou sledovány po celé těhotenství a do 6 měsíců po porodu.

   1.2. Multicentrická porovnávaná případová-kontrolní studie Druhá část je případová kontrolní studie, kde budou pacientky s těhotenstvím komplikovaným PIH/PE/předčasným porodem/IUGR porovnány s normotenzními kontrolami, odpovídajícími podle mateřského a gestačního věku, parity, kuřáckého chování, BMI a etnického původu. skupina. Pacientky budou sledovány po celou dobu (zbytek těhotenství) a do 6 měsíců po porodu. Pacienti v této studii budou zařazeni do UZA, Erasmus MC, Maastricht UMC, ZOL (Ziekenhuis Oost-Limburg).

2. Popis vyšetření 2.1 Endoteliální funkce (RHI): Index reaktivní hyperémie se měří pomocí tonometrie periferních tepen (PAT) (endoPAT®, Itamar). Tonometr se skládá z prstového pletysmografu, který je schopen snímat objemové změny v cévách ukazováčků. Je to technika nezávislá na operátorovi, a tudíž reprodukovatelná. Senzory jsou umístěny na konečcích prstů ukazováčků.

Suprasystolická okluze nedominantní horní části paže, při 200 mmHg nebo 60 mmHg nad systolickým krevním tlakem, bude získána pomocí manžety. Po okluzi horní části paže bude měřena odpověď na reaktivní hyperémii. Kontralaterální (dominantní) rameno se používá jako kontrola, ke korekci systémových účinků.

2.2 Arteriální tuhost (PWV, PWA): Rychlost pulzní vlny a analýza pulzní vlny budou vypočítány pomocí systému Sphygmocor® (Atcor Medical, West Ryde, Austrálie). Pro výpočet PWV je třeba změřit dvě tlakové vlny ve známé vzdálenosti od sebe a vzdálenost mezi místy měření se vydělí dobou šíření. Aortální PWV se měří karotidně-femorální PWV (cfPWV), protože je to „zlatý standard“ měření tuhosti aorty. Měření cfPWV bude prováděno pomocí tlakového tonometru pro transkutánní záznam křivky tlakového pulsu v podložní tepně. Tonometr obsahuje mikromanometr, který poskytuje velmi přesný záznam tlaku v tepně. Krkavice a femorální PWV budou hodnoceny jemným stlačením krční tepny a stehenní tepny špičkou tonometru v místě maximální pulsace. Zařízení Sphygmocor automaticky vypočítá cfPWV. PWA vypočítá AIx umístěním tonometru na radiální tepnu (místo maximální pulsace). Zobecněná přenosová funkce odvodí křivku aortálního tlaku z křivky radiální tepny. Z křivky aortálního tlaku lze vypočítat augmentační tlak (AP) a augmentační index (AIx). AP (ΔP) je definována jako výška pozdního systolického vrcholu nad inflexním bodem na křivce. AIx je definován jako AP vyjádřený jako procento PP aorty. Protože AIx je ovlivněna srdeční frekvencí, bude standardizována na srdeční frekvenci 75 bmp (AIx-75).

2.3 Index tepny děložní tepny (PI UA) a fetální biometrie: Dopplerovská vyšetření děložní tepny budou provedena pomocí transabdominálního barevně řízeného pulzního vlnového Dopplera (Voluson, GE Healthcare Technologies, USA). PI obou děložních tepen bude získáno na obou stranách děložního čípku před 14. týdnem gestace a při zjevném zkřížení s vnějšími kyčelními tepnami po 14 týdnech. Současně budou měřeny základní parametry biometrie plodu: biparietální průměr, obvod hlavičky, obvod břicha, délka stehenní kosti a očekávaná hmotnost plodu pomocí Hadlocksova vzorce.

2.4 NLR a MPV: Provedením kompletního krevního obrazu bude NLR, MPV a počet krevních destiček získán pomocí hematologického systému ADVIA 120 (Siemens health, Germany).

2.5 Automatizované měření krevního tlaku: SBP (systolický krevní tlak), DBP (diastolický krevní tlak) a MAP (střední arteriální tlak) po 10 minutách odpočinku v sedě budou měřeny pomocí monitoru Mindray VS 900 (Mindray, Čína).

2.6 Oxidační stres 2.6.1 Elektronová paramagnetická rezonance: NO a O2∙- EPR (elektronová paramagnetická rezonance) je odvozena ze spektroskopie magnetické rezonance a využívá mikrovlnné záření k detekci molekul s nepárovým elektronovým číslem, jako jsou radikály. Když spektrometr EPR vytvoří magnetické pole, všechny radikály se vyrovnají. EPR spektrometr vysílá často rádiovou mikrovlnnou troubu, což způsobuje, že elektrony přeskakují z nízkoenergetického do vysokoenergetického stavu. Tuto absorpci energie lze měřit a přímo koreluje s množstvím volných radikálů ve vzorku. Bude přidána 'spin past', která zachytí velmi reaktivní radikály a prodlouží jejich poločas života. Koncentrace NO bude stanovena pomocí roztoku Iron-DETC (Fe(II)DETC2 (železo(II)diethyldithiokarbamaát). Spinovou sondou pro stanovení O2∙- (superoxidu) v mateřském séru je CMH (1-Hydroxy-3-methoxykarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin) a v placentární tkáni je to kyselina askorbová (vitamín C). Vitamin C má antioxidační účinky a je hojně zastoupen v lidském těle. O2∙- snadno reaguje s vitamínem C za vzniku askorbového radikálu. Tento askorbový radikál je měřítkem koncentrace O2∙- v placentární tkáni. Placentární tkáň bude vyšetřena v době porodu, mateřské sérum v 9. týdnu, 28. týdnu, při porodu a 6 měsíců po porodu.

2.6.2 Western blot analýza: ONOO-, eNOS en iNOS NO a O2∙- reagují za vzniku ONOO-. Produkce ONOO- bude měřena nepřímo v placentární tkáni prostřednictvím nitrace tyrosinu. Nitrotyrosin vzniká, když ONOO- reaguje s tyrosinem v proteinech a může být kvantifikován v placentární tkáni pomocí Western blottingu s použitím protilátek proti nitrotyrosinu. NO se tvoří z L-argininu pomocí NOS (Nitric Oxide Synthase). Tato reakce je regulována VEGF (Vascular endothelial growth factor), endoteliálním mitogenem, který má důležitou funkci při proliferaci endoteliálních buněk a při angiogenezi. VEGF stimuluje eNOS (endoteliální NOS) a indukuje tedy produkci NO. Placentární ischémie zvýší produkci VEGF a tím i produkci NO jako kompenzační mechanismus pro zajištění dostatečné feto-materské transfuze. V oxidativním prostředí vede nedostatek NOS-stabilizačních faktorů k NOS-odpojení. Vazba NOS způsobuje posun od výroby NO k produkci O2∙-. Tím se zachová oxidační nastavení. Produkce iNOS (inducible NOS) je indukována cytokiny a endotoxiny během zánětlivých stavů. Monoklonální protilátky budou určovat koncentrace eNOS a iNOS v placentární tkáni.

STATISTICKÁ ANALÝZA

1. Výpočet velikosti vzorku 1.1. Prospektivní longitudinální studie v jednom centru Pro fyziologickou studii RHI v těhotenství výzkumníci vypočítali, že pro 95% interval spolehlivosti je standardní odchylka populace 0,5 (jak je popsáno v jiných populacích pro RHI) a tolerovatelná standardní chyba průměru (SEM ) hodnota 0,1, je třeba sledovat 97 žen. Vezmeme-li v úvahu alespoň 10% neúčasti, bude počáteční velikost vzorku 110 žen.

   1.2. Multicentrická porovnávaná případová-kontrolní studie V pilotní studii Yinona [Yinon, 2006] byl index reaktivní hyperémie (RHI) u normotenzních těhotenství 1,8 au PE 1,5; ve většině populací je směrodatná odchylka 0,5. Pro 80% sílu a oboustranné α = 0,05 as ohledem na klinicky významný rozdíl 0,3 by velikost vzorku pro každou skupinu byla 44; která bude považována za velikost vzorku pro průřezovou studii srovnávající PE (44), PIH (44), IUGR (44) a předčasný porod (44) s normotenzními kontrolami (44).

2. Popisná statistika a analýza dat 2.1. Prospektivní longitudinální studie v jednom centru Pro fyziologickou studii RHI v těhotenství vypočtou výzkumníci referenční hodnoty a 95% interval spolehlivosti. Podélná data budou vykreslena a bude sestaven lineární model smíšených efektů s náhodným průsečíkem. Na základě tohoto modelu budou vypočteny percentily pro RHI a PWV. Budou analyzovány korelační koeficienty mezi základními hodnotami RHI, PWV, UA Doppler PI, fetální biometrií, NLR, MPV, MAP, percentilem porodní hmotnosti a EDC.

2.2. Multicentrická shodná případová-kontrolní studie RHI, PWV, UA Doppler PI, fetální biometrie, NLR, MPV, MAP, porodní hmotnost a EDC a další kontinuální proměnné u hypertenzních versus nehypertenzních těhotenství budou testovány na normalitu pomocí Shapiro Wilk testu. Pokud existuje normalita, budou vyjádřeny jako průměr, standardní odchylky a 95% intervaly spolehlivosti a porovnány pomocí oboustranného T testu. Pokud ne, budou vyjádřeny jako medián a interkvartilní rozsahy a porovnány pomocí Mann Whitney U testu.