Investigando os perfis metabólicos e lipidômicos associados a graus variados de maculopatia diabética e retinopatia no sul de Gales (IMLADRIS)

Introdução

A retinopatia diabética (DR) coloca um enorme fardo aos serviços clínicos oftálmicos em todo o mundo como uma das principais causas da visão reduzida em adultos em idade ativa [1,2]. Isso só vai piorar à medida que a população cresce com estimativas de 700 milhões de pacientes em todo o mundo até 2045, com aumento de pessoas com DR de cerca de 103 milhões em 2020 a 160 milhões em 2045 [3]. A fisiopatologia do DR é pouco caracterizada e, embora entendamos alguns aspectos do processo da doença, alguns permanecem inexplorados.

No início do desenvolvimento do DR, há um colapso da barreira-retiniana do sangue com perda de pericitos. Isso permite vazamento de constituintes vasculares na retina e também fluxo de marcadores metabólicos do tecido da retina para a circulação sistêmica [4]. Existem vários aspectos desse processo que justificam uma investigação mais aprofundada de uma perspectiva dos distúrbios metabólicos que ocorrem e o que pode estar conduzindo -os.

No início do desenvolvimento de DR, há interrupções na auto -regulação do fluxo sanguíneo para a retina com um aparente distúrbio no metabolismo da arginina, refletido na análise metabolômica sérica [5,6]. Essa evidência e evidência de alterações subsequentes na oxidação de ácidos graxos, bem como a síntese lipídica complexa, são derivados de modelos animais e pequenos estudos populacionais em coortes étnicas muito específicas, como os índios Pima nos EUA [5,7]. Além disso, parece haver evidências limitadas para um efeito no metabolismo da purina, que é crucial para a síntese de fosfocolina e fosfatidiletanolamina [8].

Juntamente com a interrupção na síntese desses lipídios cruciais, o metabolismo da ceramida é perturbado com uma redução no "probarrier", ceramidas de cadeia muito longa e aumento da produção de ceramidas "pró-apoptóticas" de cadeia mais curta [9-12]. Isso fornece um link para o potencial benefício terapêutico do fenofibrato, que foi demonstrado em estudos em larga escala como um efeito benéfico no DR, independentemente de seus efeitos nos níveis séricos de lipoproteína de baixa densidade (LDL) [9,13]. Isso é postulado para potencialmente ser devido ao metabolismo e síntese alterados de ceramida, um processo que está bem estabelecido para ser interrompido em pessoas com diabetes [14].

Todas essas evidências fornecem informações sobre algumas pequenas áreas de metabolismo e função lipídicos desregulados dentro da retina, mas é necessária uma imagem mais coerente para entender verdadeiramente o papel no potencial desenvolvimento de biomarcadores, além de entender os papéis potencialmente mecanicistas que o metabolismo lipídico perturbou no contexto do DR.

Uma área de interesse emergente é a interação entre o microbioma intestinal e a doença da retina. Neste novo campo, existem evidências de que a constituição do microbioma intestinal pode influenciar a patologia da retina que os indivíduos desenvolvem através de uma complexa interação de fatores circulantes. Uma vez que esse fator é o metabólito de um ácido biliar de Tauroursodeoxicicolic ácido (TUDCA) [15-18]. Isso atua no receptor do receptor 5 (receptor 5 (TGR5), acoplado à proteína, expresso na retina e tem algumas evidências de que reduz o acesso de células inflamatórias na retina, protegendo-a do desenvolvimento de DR e preservando os fotorreceptores [15-18]. No entanto, a evidência é um pouco escassa e não há uma compreensão completa de como esse efeito pode ocorrer e, se for realmente reproduzível em diferentes ambientes experimentais.

Como parte deste estudo, pretendemos investigar as mudanças nos lipídios dentro do sangue que podem refletir mudanças deletérias no metabolismo lipídico da retina, não apenas resultantes, mas também contribuindo para a perda da integridade da barreira-retiniana do sangue e como isso pode ser afetado pelos marcadores circulantes associados ao Microbioma LIPIDELETOLETOLETOLETOLETOLETOLENTE, e como isso pode ser afetado pelos constituintes do Microbiome LIPIDE.

Fundo

O Dr. apresenta um grande desafio à prática clínica e à prestação de cuidados de saúde pública dos países de baixa e média renda a países de alta renda, como o Reino Unido [1]. Como tal, qualquer insight sobre vias mecanicistas que possam ser exploradas para tratar o DR em um estágio anterior potencialmente proporcionam grandes benefícios ao aliviar os sistemas de saúde de uma grande quantidade de pacientes que exigem tratamento mais intensivo com uma carga maior de atendimento de acompanhamento.

Vital para o desenvolvimento de qualquer nova terapia ou biomarcador bem -sucedida é uma compreensão completa dos mecanismos fisiopatológicos fundamentais pelos quais a doença inicia e se desenvolve. Atualmente, há um bom entendimento sobre certos aspectos do DR, como o papel do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) na condução de mudanças proliferativas e no aumento da permeabilidade dos vasos subjacentes ao edema macular diabético (DMO) [19]. No entanto, relativamente pouco é entendido sobre as alterações metabólicas que ocorrem na retina para impulsionar a produção de VEGF.

Fundamentalmente, está bem estabelecido que o fraco controle glicêmico predispõe a pior DR [20,21]. No entanto, essa variação na hemoglobina A1C (HbA1c) provavelmente representa apenas aproximadamente 6,6% do risco de desenvolver visões que ameaçam o DR [5,22]. É vital que entendamos melhor o risco inexplicável de fornecer melhores cuidados antecipados para aqueles com DR.

Atualmente, temos alguns estudos sobre as mudanças no metabolismo lipídico naqueles com DR e em vários estudos em modelos murinos [7,7,9-12,18]. No momento, isso não forma uma imagem coerente de quais vias lipídicas são realmente interrompidas e podem bem sustentar as primeiras mudanças no DR. Em estudos anteriores, postula -se que o complexo metabolismo de esfingolipídios e ceramida pode refletir em parte diferenças naqueles com e sem DR [7,10,11]. Isso, no entanto, não foi repetido em diferentes grupos de pacientes e não foi validado em uma população diferente.

Da mesma forma, existem alguns estudos que investigam o papel do microbioma intestinal em doenças da retina [16,23-26]. Há um número ainda menor que se concentra na diversidade de microbiomas intestinais e no desenvolvimento de DR [26,27]. Crucialmente, parece haver algumas boas evidências de que o microbioma intestinal pode influenciar o desenvolvimento de DR via vias ainda mal definidas [27].

Nosso estudo proposto tem como objetivo investigar as mudanças no metabolismo lipídico em pessoas com diferentes graus de DR, com esse conhecimento, poderemos entender melhor como essas mudanças podem predispor os indivíduos a desenvolver vários graus de DR e potencialmente fornecer novos alvos terapêuticos para intervenção futura.

Pergunta de pesquisa

Existem lipídios plasmáticos no sangue que podem refletir estágios diferentes de DR, potencialmente atuam como um biomarcador para orientar a triagem e fornecer uma visão mecanicista da fisiopatologia do DR?

Esboço do estudo

Objetivos e objetivos

Objetivo primário

- Investigar o lipidoma sérico em pessoas com uma gravidade diferente de DR

Objetivos secundários

• Para comparar os marcadores lipidômicos naqueles com e sem maculopatia diabética para obter uma visão mecanicista em potencial
• Investigar a interação de marcadores circulantes associados ao microbioma e como isso pode influenciar o metabolismo lipídico na retina e a gravidade do DR expressa por um indivíduo
• Para mapear as vias de metabolismo lipídico que podem contribuir para o desenvolvimento de diferentes graus de DR

Método

Tipo de estudo

Estudo observacional de caso-controle

Visão geral do estudo

Estudo observacional de caso-controle comparando perfis lipidômicos e metabolômicos em pessoas com diabetes e graus variados de DR e DMO, conforme descrito abaixo. Eles serão rastreados e recrutados por meio de participação e identificação de rotina clínica de nosso banco de dados clínica atual de pacientes com DR. Eles receberão informações sobre o estudo antes do consentimento.

Após esses dados, será coletada de seus registros de casos, incluindo dados demográficos básicos, histórico médico, terapia atual para diabetes e detalhes de seu diagnóstico oftalmológico, incluindo parâmetros relevantes da tomografia de coerência óptica (OCT) e exame clínico, incluindo o logaritmo do ângulo mínimo de resolução (logmar). Eles fornecerão amostras de soro e urina. Para minimizar o impacto do estudo aos participantes e os custos adicionais implícitos, essa coleta de amostras será realizada em visitas de rotina clínicas sempre que possível por membros da equipe de pesquisa do Prince Philip Hospital (PPH).

Os participantes terão todos os dados pseudo-anônimos na coleção com um banco de dados de informações identificáveis ​​e IDs de estudo designados mantidos no arquivo de estudo no HDDUHB em um escritório seguro bloqueado. Como é um estudo observacional de caso-controle, não haverá randomização, e o cegamento ocorrerá apenas no estágio de processamento e análise da amostra e a equipe de pesquisa em HDDUHB só terá acesso aos dados pseudo-anônimos.

Populações de estudo, seleção de assuntos, recrutamento e cronograma de estudo

Identificação e recrutamento potenciais de participantes retrospectivos:

Os pacientes elegíveis serão identificados a partir dos registros de casos pela equipe de cuidados diretos do banco de dados DR pré-existente HDDUHB e outras fontes clínicas, incluindo registros de presença da clínica. A inclusão dos enfermeiros de pesquisa como parte da equipe de entrega de pesquisa permitirá uma organização mais eficiente da visita do estudo, incluindo consentimento informado e coleta de amostras pelos enfermeiros de pesquisa como parte do estudo sobre a participação normal da clínica. Isso melhora a eficiência da organização das visitas ao estudo em torno de visitas à clínica. Isso foi discutido com pacientes com diabetes que concordaram que essa era uma abordagem aceitável e preferível para facilitar a organização da visita de coleta de amostras.

Esses pacientes serão contatados em um processo ad hoc por meio de carta de convite e folha de informações dos participantes (PIs) e o folheto de GDPR mais atualizado para pacientes do departamento de P&D de HDDUHB. Isso será seguido pela equipe de pesquisa com uma entrevista por telefone das enfermeiras de P&D. Isso aderirá ao cronograma de triagem telefônico (consulte o Apêndice) se o participante comunicar sua vontade de participar. Essa "entrevista" compreenderá amplamente a vontade de participar de um potencial participante de participantes, uma avaliação de sua elegibilidade e organização da visita ao estudo - isso não fará parte da coleta de dados de pesquisa. Se eles desejarem ser incluídos no estudo, uma visita ao departamento de P&D será organizada em torno de sua participação na clínica padrão. Esta visita será para uma avaliação adicional da elegibilidade antes do consentimento informado e da coleta de amostras.

Recrutamento prospectivo:

Os pacientes que frequentam clínicas de serviço de retina médica com DR recém -diagnosticado de graus ou DMO variados receberão um PIs, o folheto mais atualizado do GDPR para pacientes do Departamento de P&D de HDDUHB e carta de convite antes da participação na clínica. O clínico de revisão discutirá o estudo com o paciente e os convidará a participar antes da revisão clínica. No caso de um paciente elegível que é um novo caso identificado no dia, o clínico pode introduzir o estudo e fornecer a carta de PIs e convite ao paciente enquanto aguarda exames de OCT e revisão clínica. O clínico compartilhará os potenciais detalhes dos participantes com a equipe de entrega de pesquisa para organizar a visita do estudo, incluindo avaliação adicional de elegibilidade, consentimento informado e coleta de amostras.

Além disso, haverá pôsteres divulgando o estudo publicado na PPH, que conterá informações de contato para a equipe de estudo para que os participantes em potencial interessados ​​possam entrar em contato com a equipe de estudo. Depois disso, eles receberão a carta de convite e os PIs, que serão seguidos por uma ligação telefônica da equipe de entrega de pesquisa para avaliar a elegibilidade e planejar a participação no estudo.

Isso é descrito no seguinte diagrama de fluxo:

O consentimento será fornecido durante a participação do departamento de P&D se a pessoa concordar em participar e atender aos critérios de inclusão e exclusão.

Nosso objetivo é recrutar 14 a 20 pacientes nos grupos definidos abaixo na Seção 2.2.4, Isso satisfaria os cálculos de energia descritos abaixo.

Critérios de elegibilidade

Os critérios de inclusão serão:

Diagnóstico de diabetes mellitus tipo 2, masculino ou feminino com idades entre 18 e 80 anos, inclusive

Os critérios de exclusão serão:

Participante incapaz ou não disposto a consentir em inclusão no tratamento prévio do estudo com terapias intravítreas para participante potencial de DMO com uma doença infecciosa conhecida que pode colocar em risco a equipe de estudo (por exemplo. TB, HIV, hepatite) Idade 17 anos ou menos ou 81 anos ou mais condição genética subjacente conhecida que afeta o metabolismo lipídico

Os participantes serão alocados em um dos seis grupos, com base em seus graus variados de doença ocular diabética, conforme detalhado abaixo:

Grupo 1 - Nenhum grupo de retinopatia ou maculopatia diabético 2 - Grupo de DR pré -proliferativo 3 - DR pré -proliferativo moderado Grupo 4 - Grupo de DR pré -proliferativo grave pré -proliferativo 5 - Grupo DR proliferativo 6 - DMO com qualquer grau de DR e sem tratamento anterior

Cálculo de potência

Cálculo de potência

Para o resultado primário dos marcadores lipidômicos, baseamos nossos cálculos em três estudos anteriores. O primeiro é Yun et al., 2020, que demonstrou concentrações alteradas de acilcarnitina C16 (CA (C16: 0). Aqui, o CA (C16: 0) foi em média 0,35 μM menor naqueles com DR do que aqueles sem (média ± desvio padrão: 0,125 ± 0,025 μm vs 0,09 μm). O segundo estudo é o de He et al., 2024, que compara vários lipídios entre aqueles com DM2 e DR versus aqueles com DM2 e nenhum dr. Em seguida, estuda aqueles com DM2 e DR demonstraram ceramida (D18: 0/24: 0) (CER (D18: 0/24: 0)) de 22.36 Log2 Dados transformados em 23.00 naqueles sem DR com um desvio padrão de aproximadamente 0,5 unidades log2.

Usando a fórmula abaixo para o cálculo de tamanhos de amostra:

n = 2 [(z_α+z_π)^2/{((μ_OBS-μ_CON))/σ}^2]

Onde z é da distribuição normal padronizada, representando significância e poder. Definimos o nível de significância em 5% (chance de um erro do tipo I), z_α = 1,96. Definimos a potência (π) a 90% (100% - β, a chance de um erro do tipo II) dando z_π = 1,282.

Isso gerou um tamanho de grupo de 11 para CA (C16: 0) e 13 para CER (D18: 0/24: 0). Assim, grupos de pelo menos 14 devem fornecer energia adequada com base nos cálculos acima.

Plano de Análise Estatística

Análise Estatística Processamento de dados: Usando protocolos padrão já estabelecidos no grupo da JLG usando extração de dados padronizada e normalização para o software Lipidomic and Metabolomic Techniques: Pychem, Umetrics Simca, R Studio, metaboanalyst 3.0 e roccet. Análise de dados: ANOVA bidirecional univariada adequada para dados paramétricos e testes de Kruskal-Wallis para dados não paramétricos serão usados ​​para testes estatísticos de parâmetros clínicos adequados. A análise estatística multivariada, incluindo PLS-DA e análise de cluster herdeiro de redes metabólicas, será realizada para dados lipidômicos e metabolômicos. A análise de regressão será usada para a análise de parâmetros clínicos e potenciais biomarcadores. A análise da curva característica operacional do receptor será usada para avaliar seu desempenho na discriminação de diferentes severidades de DR e DMO.

Limiar de significância: p <0,05 com correções para taxas de descoberta falsas.

Estudo resultados

O resultado do estudo será concluído na análise dos lipídios circulantes para fornecer o insight sobre se há alguma alteração nos lipídios e metabólitos circulantes sistêmicos que possam estar associados ao DR e potencialmente fornecem algum mecanismo explicativo para a expressão diferencial da doença em diferentes indivíduos.

Escala de tempo

O estudo se aplicará ao patrocínio do HDDUHB por meio do Grupo de Qualidade e Patrocínio da Pesquisa (RQSG) até outubro de 2024, com o objetivo de proceder ao NHS REC e HRA/HCRW Review em novembro/dezembro de 2024. O status do portfólio será avaliado como parte da revisão HRA/HCRW. Após as aprovações e a configuração local, a data-alvo para iniciar o recrutamento é de janeiro de 2025, com visitas de estudo para começar a partir de meados de janeiro de 2025 por até 12 meses a janeiro de 2026. A análise ocorrerá a partir de julho de 2025 e a finalização dos resultados e envio para publicação de abril de 2026 com análise contínua do plasma sanguíneo e metabólitos de urina e lipídios até janeiro de 2030 apenas para este estudo aqui. O tempo de retenção é maior que a análise inicial, para que qualquer re-análise possa ser realizada, caso haja alguma discrepância nos resultados ou para validar os achados do estudo. Depois que essa análise for concluída, as amostras serão destruídas, isso pode ser antes de janeiro de 2030.

O final do estudo é definido como a conclusão de todas as visitas ao estudo e a conclusão de todas as análises metabolômicas e lipidômicas em amostras coletadas.

Política de publicação

Os resultados serão enviados para publicação e apresentação revisadas por pares em conferências para disseminação. Em qualquer caso de publicação ou apresentação, apenas informações anônimas serão publicadas a partir da qual nenhum participante individual será identificável a partir dos dados agrupados. Não haverá estudos de caso individuais ou publicação de quaisquer dados que permitiriam a identificação de qualquer voluntário. Para fins de publicação, Francis Sanders será a primeira autora, Rebecca Thomas, a segunda autora, Colm McAlinden, a terceira autora, o penúltimo autor Julian Griffin e Eirini Skidaresi, o autor final. Qualquer relatório será compartilhado com o patrocinador do estudo, HDDUHB, HCRW e toda a equipe de colaboração, e todos os participantes terão a opção de receber uma cópia dos relatórios publicados.

A propriedade dos dados decorrentes deste estudo reside com a equipe de estudo e seus respectivos empregadores. Qualquer propriedade intelectual decorrente como resultado deste estudo será compartilhada entre os colaboradores do estudo, de acordo com sua contribuição proporcional.