Функциональное исследование эндотелиальной функции и регенеративного истощения клеток (FIERCE)

Диабет 2 типа (СД2) является серьезной и распространенной проблемой глобального здравоохранения. Лица с диагнозом СД2 подвергаются повышенному риску развития атеросклеротического сердечно-сосудистого заболевания (ССЗ), основной причины глобальной заболеваемости и смертности.

Гомеостаз кровеносных сосудов играет центральную роль в состоянии здоровья сердечно-сосудистой системы. Циркулирующие сосудистые регенеративные (VR) клетки-предшественники, которые опосредуют эндогенные процессы ангиогенеза, васкулогенеза и артериогенеза, имеют решающее значение в организации восстановления сосудов. При СД2 хроническая гипергликемия и сопутствующий окислительный стресс создают дезадаптирующую среду, которая ухудшает восстановление сосудов. СД2 может привести к хроническому состоянию, известному как истощение регенеративных клеток сосудов (VRCE), характеризующемуся истощением и дисфункцией циркулирующих клеток-предшественников VR. Имеющиеся данные показывают, что VRCE, связанный с СД2, может привести к дисфункции клеток VR и нарушению восстановления сосудов.

Мы разработали многопараметрический анализ проточной цитометрии для измерения содержания клеток-предшественников VR в образцах крови. В этом анализе используется фермент цитозольной детоксикации альдегиддегидрогеназа (АЛДГ), который высоко экспрессируется в клетках-предшественниках гемопоэтических, эндотелиальных и мезенхимальных стромальных клеточных линий. Этот фермент защищает клетки-предшественники от окислительного повреждения, вызываемого активными формами кислорода. Активность АЛДГ снижается до 100 раз, поскольку клетки-предшественники дифференцируются в более расходуемые эффекторные клетки. Таким образом, мы идентифицируем клетки с высокой или низкой активностью ALDH в сочетании с маркерами клеточной поверхности, чтобы отличить подпопуляции клеток-предшественников (ALDHhi) от более дифференцированного потомства (ALDHlow). Используемый в сочетании с «боковым рассеянием» (SSC), параметром, который коррелирует с гранулярностью или сложностью клетки, этот анализ позволяет различать и количественно определять гематопоэтические/эндотелиальные клетки-предшественники ALDHhiSSClow, моноциты ALDHhiSSCmid и предшественники гранулоцитов ALDHhiSSChi. Ранее было показано, что клетки ALDHhiSSClow, полученные из костного мозга, совместно экспрессируют примитивные клеточные маркеры CD34 и CD133 и проявляют мультипотентную способность к образованию гемопоэтических колоний in vitro. В модели ишемии задних конечностей на иммунодефицитных мышах NOD/SCID трансплантация клеток ALDHhiSSClow в ишемизированную конечность приводила к улучшению восстановления перфузии мышц. Потенциал этой клеточной терапии для предотвращения ампутаций у людей с критической ишемией конечностей оценивался в условиях клинических испытаний.

В периферической крови лиц, живущих с СД2 в течение >10 лет, наблюдается истощение клеток-предшественников ALDHhiSSClow VR, более низкие частоты моноцитов ALDHhiSSCmid с репаративной функцией сосудов и повышенная частота предшественников воспалительных гранулоцитов ALDHhiSSChi по сравнению с таковыми у лиц, не живущих с СД2. . Фенотип VRCE был частично изменен у людей, живущих с СД2 и развившейся ишемической болезнью сердца (ИБС) после того, как они принимали ингибитор SGLT2 эмпаглифлозин в течение 6 месяцев. Истощение клеток VR, вызванное ожирением, также было обращено вспять через 3 месяца после бариатрической операции. Эти результаты в совокупности обеспечили механистическую связь между СД2, ожирением и нарушением гомеостаза/восстановления сосудов, а также установили, что VRCE можно терапевтически обратить вспять в условиях диабета с высоким сердечно-сосудистым риском.

FIERCE будет оценивать содержание клеток VR у людей, живущих с СД2 (продолжительностью <10 лет), и у лиц соответствующего возраста и пола, не живущих с СД2. Он также будет оценивать функцию циркулирующих клеток ALDHhi VR с помощью: (1) тонометрии эндотелиальных периферических артерий (EndoPAT) для клинического анализа функции эндотелия с помощью индекса реактивной гиперемии, (2) анализа образования мультипотентных гемопоэтических колоний in vitro, (3) анализа одноклеточных клеток. Секвенирование РНК (scRNA-seq), направленное на экспрессию мРНК, связанную с ангиогенезом, и (4) количественный анализ секретома без меток для определения изменений в секреции проангиогенного белка.

Мы предполагаем, что VRCE нарушает восстановление сосудов и регенерацию кровеносных сосудов во время СД2 и частично вызвано нарушением проангиогенных свойств субпопуляций клеток-предшественников VR. В частности, мы постулируем, что образование мультипотентных гемопоэтических колоний, экспрессия мРНК проангиогенных цитокинов и высвобождение проангиогенного белка будут ниже в подпопуляциях клеток-предшественников ALDHhi у людей, живущих с СД2, по сравнению с участниками, не живущими с СД2. Мы также прогнозируем, что люди, живущие с СД2, будут демонстрировать более низкий индекс реактивной гиперемии по сравнению с людьми, не живущими с СД2.

Характеристика дисфункции клеток-предшественников VR ALDHhi в условиях СД2 обеспечит подтверждение концепции в поддержку потенциального использования содержимого клеток VR в качестве количественного и функционального индикатора здоровья сосудов.