Funkční vyšetření endoteliální funkce a regenerační buněčné vyčerpání (FIERCE)

Diabetes typu 2 (T2D) je významným a převládajícím celosvětovým zdravotním problémem. Jedinci s diagnózou T2D jsou vystaveni zvýšenému riziku rozvoje aterosklerotického kardiovaskulárního (CV) onemocnění, hlavní příčiny celosvětové morbidity a mortality.

Homeostáza krevních cév hraje ústřední roli ve stavu kardiovaskulárního zdraví. Cirkulující vaskulární regenerační (VR) progenitorové buňky, které zprostředkovávají endogenní procesy angiogeneze, vaskulogeneze a arteriogeneze, jsou rozhodující při organizování opravy cév. U T2D vytváří chronická hyperglykémie a doprovodný oxidativní stres maladaptivní prostředí, které zhoršuje opravu cév. T2D může vést k chronickému stavu známému jako vaskulární regenerační buněčné vyčerpání (VRCE), charakterizovanému vyčerpáním a dysfunkcí v cirkulujících progenitorových buňkách VR. Dostupné údaje naznačují, že VRCE spojená s T2D může vést k dysfunkci VR buněk a ohrožení vaskulární opravy.

Vyvinuli jsme multiparametrický test průtokové cytometrie pro měření obsahu progenitorových buněk VR ve vzorcích krve. Tento test využívá cytosolový detoxikační enzym aldehyddehydrogenázu (ALDH), který je vysoce exprimován v progenitorových buňkách z hematopoetických, endoteliálních a mezenchymálních stromálních buněčných linií. Tento enzym chrání progenitorové buňky před oxidačním poškozením, které je řízeno reaktivními formami kyslíku. Aktivita ALDH je snížena až 100krát, jak se progenitorové buňky diferencují směrem k postradatelnějším efektorovým buňkám. Jako takové identifikujeme buňky s vysokou nebo nízkou aktivitou ALDH v kombinaci s markery buněčného povrchu, abychom odlišili podskupiny progenitorových buněk (ALDHhi) od více diferencovaného potomstva (ALDHlow). Tento test, použitý ve spojení s „side scatter“ (SSC), parametrem, který koreluje s granularitou nebo komplexitou buňky, dokáže rozlišit a kvantifikovat ALDHhiSSClow hematopoetické/endoteliální prekurzorové buňky, ALDHhiSSCmid monocyty a ALDHhiSSChi prekurzory granulocytů. Dříve se ukázalo, že buňky ALDHhiSSClow pocházející z kostní dřeně koexprimují markery primitivních buněk CD34 a CD133 a vykazují multipotentní schopnost tvořit hematopoetické kolonie in vitro. V imunodeficitním NOD/SCID myším modelu ischemie zadní končetiny vedla transplantace buněk ALDHhiSSClow do ischemické končetiny ke zlepšení obnovy svalové perfuze. Potenciál této buněčné terapie zabránit amputacím u jedinců s kritickou ischemií končetiny byl hodnocen v prostředí klinických studií.

Periferní krev jedinců žijících s T2D déle než 10 let vykazuje depleci progenitorových buněk ALDHhiSSClow VR, nižší frekvence ALDHhiSSCmid monocytů s cévní reparační funkcí a zvýšenou frekvenci ALDHhiSSChi zánětlivých prekurzorů granulocytů ve srovnání s jedinci nežijícími s T2D . Fenotyp VRCE byl částečně zvrácen u lidí žijících s T2D a prokázaným onemocněním koronárních tepen (CAD) poté, co byli 6 měsíců na inhibitoru SGLT2 empagliflozinu. Deplece buněk VR vyvolaná obezitou byla také zvrácena 3 měsíce po bariatrické operaci. Tyto nálezy společně poskytly mechanické spojení mezi T2D, obezitou a narušenou homeostázou/opravou cév a také prokázaly, že VRCE může být terapeuticky zvráceno v diabetickém prostředí s vysokým KV rizikem.

FIERCE posoudí obsah VR buněk u jedinců žijících s T2D (<10 let trvání) a jedinců stejného věku a pohlaví, kteří nežijí s T2D. Bude také hodnotit funkci cirkulujících ALDHhi VR buněk prostřednictvím: (1) endoteliální periferní arteriální tonometrie (EndoPAT) pro klinickou analýzu endoteliální funkce prostřednictvím reaktivního hyperemického indexu, (2) multipotentních testů tvorby hematopoetických kolonií in vitro, (3) jednobuněčných RNA-sekvenování (scRNA-seq), které je zaměřeno na expresi mRNA spojenou s angiogenezí, a (4) kvantitativní analýzy sekretomů bez značení ke stanovení změn v proangiogenní sekreci proteinů.

Předpokládáme, že VRCE narušuje vaskulární opravu a regeneraci krevních cév během T2D a je částečně způsobena narušenými proangiogenními vlastnostmi podskupin progenitorových buněk VR. Konkrétně předpokládáme, že tvorba multipotentních hematopoetických kolonií, exprese proangiogenní cytokinové mRNA a uvolňování proangiogenního proteinu budou nižší v podskupinách progenitorových buněk ALDHhi od jedinců žijících s T2D ve srovnání s účastníky, kteří s T2D nežijí. Také předpovídáme, že jedinci žijící s T2D budou vykazovat nižší reaktivní hyperemický index ve srovnání s jedinci, kteří s T2D nežijí.

Charakterizace dysfunkce progenitorových VR buněk ALDHhi v nastavení T2D vytvoří důkaz o konceptu na podporu potenciálního využití obsahu VR buněk jako kvantifikovatelného a funkčního indikátoru vaskulárního zdraví.