Badanie funkcjonalne funkcji śródbłonka i wyczerpania komórek regeneracyjnych (FIERCE)

Cukrzyca typu 2 (T2D) jest poważnym i powszechnym problemem zdrowotnym na całym świecie. Osoby, u których zdiagnozowano T2D, są obarczone podwyższonym ryzykiem rozwoju miażdżycowej choroby układu krążenia (CV), głównej przyczyny globalnej zachorowalności i śmiertelności.

Homeostaza naczyń krwionośnych odgrywa kluczową rolę w stanie zdrowia układu sercowo-naczyniowego. Krążące komórki progenitorowe regeneracyjne naczyń (VR), które pośredniczą w endogennych procesach angiogenezy, waskulogenezy i arteriogenezy, mają kluczowe znaczenie w organizowaniu naprawy naczyń. W T2D przewlekła hiperglikemia i towarzyszący mu stres oksydacyjny tworzą nieprzystosowawcze środowisko, które upośledza naprawę naczyń. T2D może prowadzić do stanu przewlekłego zwanego wyczerpaniem komórek regeneracyjnych naczyń (VRCE), charakteryzującego się wyczerpaniem i dysfunkcją krążących komórek progenitorowych VR. Dostępne dane wskazują, że VRCE związane z T2D może prowadzić do dysfunkcji komórek VR i upośledzenia naprawy naczyń.

Opracowaliśmy wieloparametryczny test cytometrii przepływowej do pomiaru zawartości komórek progenitorowych VR w próbkach krwi. W teście tym wykorzystuje się enzym dehydrogenazy aldehydowej (ALDH), enzym detoksykujący cytozol, który ulega silnej ekspresji w komórkach progenitorowych z linii komórek zrębowych układu krwiotwórczego, śródbłonka i mezenchymalnego. Enzym ten chroni komórki progenitorowe przed uszkodzeniami oksydacyjnymi powodowanymi przez reaktywne formy tlenu. Aktywność ALDH zmniejsza się nawet 100-krotnie, gdy komórki progenitorowe różnicują się w kierunku bardziej zbędnych komórek efektorowych. W związku z tym identyfikujemy komórki o wysokiej lub niskiej aktywności ALDH w połączeniu z markerami powierzchniowymi komórek, aby odróżnić podzbiory komórek progenitorowych (ALDHhi) od bardziej zróżnicowanego potomstwa (ALDHlow). Używany w połączeniu z „rozproszeniem bocznym” (SSC), parametrem korelującym z ziarnistością lub złożonością komórki, test ten pozwala rozróżnić i określić ilościowo hematopoetyczne/śródbłonkowe komórki prekursorowe ALDHhiSSClow, monocyty ALDHhiSSCmid i prekursory granulocytów ALDHhiSSChi. Wcześniej wykazano, że komórki ALDHhiSSClow pochodzące ze szpiku kostnego wykazują wspólną ekspresję prymitywnych markerów komórkowych CD34 i CD133 i wykazują multipotencjalną zdolność tworzenia kolonii krwiotwórczych in vitro. W mysim modelu niedokrwienia kończyny tylnej z niedoborem odporności NOD/SCID przeszczepienie komórek ALDHhiSSClow do niedokrwionej kończyny doprowadziło do poprawy przywrócenia perfuzji mięśni. Potencjał tej terapii komórkowej w zapobieganiu amputacjom u osób z krytycznym niedokrwieniem kończyn oceniano w warunkach badań klinicznych.

We krwi obwodowej osób chorych na T2D od ponad 10 lat obserwuje się zmniejszenie liczby komórek progenitorowych ALDHhiSSClow VR, niższą częstość występowania monocytów ALDHhiSSCmid mających funkcję naprawy naczyń oraz zwiększoną częstość występowania prekursorów granulocytów zapalnych ALDHhiSSChi w porównaniu z krwią osób nie chorujących na T2D. . Fenotyp VRCE został częściowo odwrócony u osób cierpiących na T2D i rozpoznaną chorobę wieńcową (CAD) po przyjmowaniu przez nie empagliflozyny, inhibitora SGLT2, przez 6 miesięcy. Wywołany otyłością ubytek komórek VR został również odwrócony 3 miesiące po operacji bariatrycznej. Odkrycia te łącznie dostarczyły mechanicznego powiązania między T2D, otyłością i upośledzoną homeostazą/naprawą naczyń, a także wykazały, że VRCE może zostać terapeutycznie odwrócony w środowisku chorych na cukrzycę o wysokim ryzyku CV.

FIERCE oceni zawartość komórek VR u osób chorych na T2D (czas trwania <10 lat) oraz u osób dobranych pod względem wieku i płci, które nie cierpią na T2D. Oceni także funkcję krążących komórek ALDHhi VR za pomocą: (1) tonometrii śródbłonkowej tętnic obwodowych (EndoPAT) w celu klinicznej analizy funkcji śródbłonka za pomocą wskaźnika reaktywnego przekrwienia, (2) multipotencjalnych testów tworzenia kolonii hematopoetycznych in vitro, (3) testów jednokomórkowych Sekwencjonowanie RNA (scRNA-seq), które koncentruje się na ekspresji mRNA związanej z angiogenezą oraz (4) ilościowe analizy sekretomu bez znaczników w celu określenia zmian w wydzielaniu białka proangiogennego.

Stawiamy hipotezę, że VRCE upośledza naprawę naczyń i regenerację naczyń krwionośnych podczas T2D i jest częściowo spowodowane upośledzonymi właściwościami proangiogennymi podzbiorów komórek progenitorowych VR. W szczególności postulujemy, że tworzenie multipotencjalnych kolonii krwiotwórczych, ekspresja mRNA proangiogennych cytokin i proangiogenne uwalnianie białka będą niższe w podzbiorach komórek progenitorowych ALDHhi od osób żyjących z T2D w porównaniu z uczestnikami nie żyjącymi z T2D. Przewidujemy również, że osoby żyjące z T2D będą wykazywały niższy wskaźnik przekrwienia reaktywnego w porównaniu z osobami nie chorującymi na T2D.

Charakterystyka dysfunkcji komórek progenitorowych VR ALDHhi w przebiegu T2D wygeneruje dowód słuszności koncepcji wspierający potencjalne wykorzystanie zawartości komórek VR jako wymiernego i funkcjonalnego wskaźnika zdrowia naczyń.