Cirkulerande tumör-DNA (ctDNA) rektalcancer och förhållandet till extramural venös invasion (ctDNA)

Vaskulär eller venös invasion hos patienter med rektalcancer har ansetts vara en betydande prognostisk faktor i över ett halvt sekel. Intresset för att förstå mekanismerna som styr tumörspridning från ändtarmen till avlägsna platser som levern har drivit studiet av lymfatisk och vaskulär invasion av maligna celler. Venös invasion har traditionellt identifierats vid histologisk analys av resektionsprover men det finns fortfarande variation mellan patologer. Inkonsekvenser i de histologiska metoder som används för att identifiera venös eller vaskulär invasion har lett till svårigheter att tolka den faktiska förekomsten eller prevalensen; litteraturen rapporterar prevalens mellan 9-61%. Icke desto mindre anses EMVI vara en oberoende prognostisk faktor och har som sådan erkänts av Royal College of Pathologists i Storbritannien genom att inkludera den i minimidatauppsättningen för rapportering av kolorektal cancer.

På senare tid har den ökande noggrannheten av högupplöst magnetisk resonanstomografi (MRI) inneburit att prognostiska faktorer som extra mural venös invasion med säkerhet kan identifieras vid bildbehandling. Litteraturen har visat att EMVI kan identifieras väl med hjälp av MRT. mrEMVI har också visat sig vara en oberoende prognostisk faktor för sjukdomsåterfall efter kemoradioterapi. Dessutom kan MRT identifiera ytterligare fall av EMVI jämfört med rutinhistopatologi och graden av förbättring av mrEMVI på post-CRT-skanningar är associerad med förbättrad sjukdomsfri överlevnad.

Cirkulerande cellfritt tumör-DNA (ctDNA) kan detekteras i blodet hos patienter med både metastaserande och primärt karcinom. På grund av närvaron av EMVI är det troligt att tumörceller och DNA-fragment är mer benägna att fällas, och en högre blodcirkulerande % mutationsfrekvens kommer att ses jämfört med patienter som är mrEMVI-negativa.

Dessa tumörfragment kan sedan fungera som mikroemboli till andra platser och potentiellt öka risken för att utveckla metastaser. Vidare kan intraoperativ manipulation av själva tumören leda till större frisättning av tumörceller i den mesenteriska cirkulationen, vilket föreslås av kilformade defekter i levern efter kirurgisk resektion på grund av portalventrombi.

Det finns flera sätt att identifiera cellfritt tumör-DNA. Studier med polymeraskedjereaktion (PCR- ett sätt att koncentrera mängden ctDNA för att bli en meningsfull mätbar mängd som sedan kan användas för att bedöma avvikelser) visade också att ctDNA är associerat med ökad risk för återfall av sjukdomen och sämre överlevnadsresultat. Det finns ingen standardteknik och störande faktorer finns i varje steg av analysen av ctDNA, vilket kan leda till provtagningsfel och inkonsekvenser. Detta ledde till utveckling av flera tekniker för att försöka öka isoleringen av DNA såsom snabbspinkolonner så att ctDNA bara binder till en silikagel och sedan elueras med vatten eller ett buffertsystem. Polymeraskedjereaktion kan användas för att kvantifiera tumör-ctDNA. Andra tekniker inkluderar dubbelspinning och användning av fenol-kloroform, amplifieringsmetoder eller snabb spinning för att hämta små DNA-fragment. Tidiga studier mätte och kvantifierade den totala mängden cirkulerande DNA och fann att högre mängder totalt cellfritt DNA var associerat med tumör. ctDNA från tumörceller kan särskiljas från normalt ctDNA genom att undersöka dess profil i förhållande till storlek och fragmentering, men debatt uppstod om huruvida längre eller kortare fragment var associerade med tumör vilket resulterade i oklara slutsatser. Det har antagits att cirkulerande tumör-DNA härrör från tumör, normal vävnad eller tumörassocierade stromaceller, men tumörhärlett ctDNA tenderade att vara mer fragmenterat och uppvisa en större variation i storlek även om totalt sett var större än ctDNA som härrörde från normal vävnad.

Undersökning av om det finns en spik i den intraoperativa fasen skulle vara av intresse. En ytterligare studie visar att återkommande sjukdom är relaterad till ctDNA-ökningar och är högre hos patienter med metastaserad sjukdom och dessutom har de patienter med högre ctDNA-nivåer och metastaser en sämre prognos. Utmaningen med denna typ av analys är att det cellfria DNA:t kan eller inte kan vara direkt relaterat till tumören och därför har man på senare tid fokuserat på tumörspecifikt cellfritt tumör-DNA som definieras av kända mutationer som kras och p53 (tumör). p53 kallas tp53).

Vid kolorektal cancer har majoriteten av patienterna icke-hypermuterade tumörer på histologi. Av de hypermuterade tumörerna utgör TP53 och KRAS 60 % respektive 43 % av mutationerna. Utredarna kommer att screena blodbaserat ctDNA för p53 och KRAS. När utredarna tar blodet kommer de att få en viss mängd cirkulerande DNA som kan vara tumör eller normalt och sedan analyserar de detta för att se om det har mutationerna och om det gör det kan utredarna kalla det ctDNA (cirkulerande tumör-DNA). Om det inte finns någon mutation utesluter detta inte nödvändigtvis ctDNA eftersom det finns en känslighet och specificitet förknippad med analysmetoderna för mutationerna (dvs KRAS och tp53) och inte alla tumörer kommer att ha KRAS- eller p53-mutationerna. I vissa rapporter från kolorektal cancer korrelerar upptagningshastigheten för dessa mutationer i blodet till 100 % av de tumörer som visat sig ha samma mutation på histologi. Dessutom kan plasma- eller serumprovtagning vara känsligare och i en kohort på 100 patienter kan upptagningshastigheten av tumörer vara upp till 70 % för den ena eller andra mutationen (kras och TP53). I andra cancerformer som lungcancer, plockar utredarna upp 65 % av mutationerna i blodet, därför kan utredarna i genomsnitt förvänta sig att detektera 0,65 x 60 = 39 % av patienterna som har detekterbara mutationer i blodet. För denna studie är det sannolikt då att upphämtningsgraden kommer att ligga mellan 39 - 70%. I denna grupp kommer utredarna att kunna jämföra ctDNA-profilen mellan EMVI-positiva och negativa tumörer efter neoadjuvant långkurerad kemoradioterapi och avgöra om ctDNA-profilen förändras intraoperativt.