Day-4 Embryodefragmentering: Blastocystfrekvens och kliniska utfall (DEBRIS)

BAKGRUND OCH VETENSKAPLIG MOTIVERING Embryonell fragmentering är en av de vanligast observerade morfologiska avvikelserna under in vitro-odling inom assisterad reproduktionsteknik (ART).
Anukleära cytoplasmatiska fragment uppstår från asymmetrisk celldelning eller apoptotiska processer och kan påverka en varierande andel av embryovolymen.
Deras närvaro har konsekvent associerats med minskad implantationspotential, lägre blastocystbildningsfrekvenser och sämre kliniska utfall i IVF/ICSI-cykler.

Nuvarande embryograderingssystem, inklusive Istanbul-konsensus och Gardner-poängsystemet för blastocyster, inkluderar fragmentering som en nyckelmorfologisk parameter.
Embryon med fragmentering ≥10 % vid klyvningsstadier anses generellt ha en reducerad men inte frånvarande utvecklingspotential, och deras hantering – särskilt om aktiv intervention för att avlägsna fragment är fördelaktig – förblir ett ämne för pågående debatt.

Mekanisk och laserassisterad embryodefragmentering vid tidiga klyvningsstadier (dag 2–dag 3) har praktiserats i utvalda ART-laboratorier i flera decennier.
Motiveringen är att fysisk borttagning av anukleära fragment kan lindra utvecklingsbegränsningar på blastomerer, minska cytotoxisk eller apoptotisk signalering och förbättra kompaktering och blastocystbildning.
Publicerad evidens om tidig defragmentering är dock heterogen: vissa studier rapporterar förbättringar i blastocystutveckling och graviditetsfrekvenser, medan andra inte visar någon signifikant fördel eller till och med potentiell skada på grund av mekanisk stress under manipulation.

En kritisk lucka i litteraturen avser defragmentering utförd vid dag 4 (D4) av odling, motsvarande morula- och tidigt kompakteringsstadium.
Vid D4 genomgår embryon som framgångsrikt har upprätthållit utvecklingskompetens kompaktering – en nyckelmorfogenetisk händelse som involverar cellpolarisering, tight junction-bildning och etablering av inner cell mass- och trofektodermlinjer.
Den biologiska motiveringen för D4-defragmentering skiljer sig från tidigare interventioner: vid detta stadium kan förhållandet mellan fragment och kompakterande blastomerer vara tydligare definierat, och borttagning av fragment kan med mindre sannolikhet störa pågående celldelning samtidigt som det potentiellt stödjer kompakteringsprocessen.

Preliminära observationsdata från vårt centrum tyder på att D4-defragmentering kan associeras med högre frekvenser av användbara blastocyster jämfört med historiska kontroller, särskilt i embryon med måttlig fragmentering (10–50 %).
Dessa preliminära fynd, även om de är uppmuntrande, erhölls från icke-randomiserade data och är föremål för urvalsbias.
En prospektiv randomiserad kontrollerad studie (RCT) är därför nödvändig för att avgöra om D4-defragmentering genuint förbättrar utvecklings- och kliniska utfall.

STUDIEDESIGN Detta är en prospektiv, randomiserad, kontrollerad, enkelblindad studie (DEBRIS-D4 / DEFRAG-D4-studien).
Studien är utformad enligt CONSORT-riktlinjer för rapportering av randomiserade studier och följer SPIRIT-checklistan för kliniska studieprotokoll.

Enkelblindad design: Embryologen som utför blastocystkvalitetsbedömning vid D5/D6 och sonografen som utvärderar klinisk graviditet kommer att vara blindade för behandlingsarmsindelningen.
Blindning av embryologen som utför D4-proceduren är inte genomförbar på grund av interventionens natur.

Randomiseringsenhet: Randomisering sker på patientnivå (inte embryonivå), för att undvika kontamination mellan grupper och för att återspegla den kliniska verkligheten för embryokohorthantering.

Stratifieringsfaktorer:

Patientålder: <35 år mot. ≥35 år Antal embryon med ≥10 % fragmentering vid D4: 1–2 mot. ≥3 Användning av preimplantatorisk genetisk testning för aneuploidi (PGT-A): ja mot. nej

Randomiseringsmetod: Förgenererade blockrandomiseringslistor med varierande blockstorlekar (4 och 6), hanterade genom sekventiellt numrerade förseglade ogenomskinliga kuvert.
Kuvert öppnas på morgonen dag 4, efter att morfologisk utvärdering bekräftar närvaron av minst ett embryo som uppfyller inklusionskriterier.

STUDIEPOPULATION

Inklusionskriterier:

Kvinnliga patienter som genomgår IVF/ICSI-cykler vid deltagande centrum Ålder 18–43 år Basal FSH < 20 mIU/mL Närvaro av ≥1 embryo med ≥10 % cytoplasmatisk fragmentering vid D4-morfologisk utvärdering Embryon avsedda för utökad odling till blastocyststadium (D5/D6) Skriftligt informerat samtycke erhållet före någon studie-relaterad procedur

Exklusionskriterier:

Donatorgametcykler (ägg- eller spermdonation) Cykler med preimplantatorisk genetisk testning för monogen sjukdom (PGT-M) som primär indikation Embryon med diffus fragmentering >50 % eller allvarlig morfologisk kompromiss vid dag 3 Samtidigt deltagande i andra interventionsstudier som kan störa studieutfall Oförmåga att ge informerat samtycke

INTERVENTIONER

Grupp A – D4-defragmentering (intervention):

Mekanisk eller laserassisterad defragmentering kommer att utföras dag 4 (96 ± 2 timmar post-fertilisering), omedelbart efter morgonens morfologiska bedömning.
Alla embryon som tillhör patienter randomiserade till grupp A med ≥10 % fragmentering kommer att genomgå proceduren.

Defragmenteringsproceduren kommer att utföras under standardmikromanipuleringsförhållanden:

Miljö med låg ljusexponering Kontrollerad temperatur vid 37°C (värmd plattform) Maximal tid utanför inkubatorn per patient: ≤10 minuter Teknik: mekanisk defragmentering med biopsipipett eller laserassisterad borttagning (enligt centrumspecifika standardoperativa procedurer) Efter defragmentering kommer embryon att återföras till odling under samma standardförhållanden (time-lapse-inkubator eller konventionell inkubator, som tillämpligt)

Grupp B – Standardodling (kontroll):

Embryon i kontrollarmen kommer inte att få någon ytterligare manipulation utöver rutinmorfologisk bedömning vid D4.
För att säkerställa jämförbarhet av odlingsförhållanden mellan grupper kommer D4-bedömningen i kontrollpatienter att utföras av samma operatör med samma varaktighet av inkubatoröppning som i interventionsgruppen (dvs. embryon kommer att tas ut kort för utvärdering men omedelbart återföras utan intervention).

Laboratoriestandardisering:

För båda armarna kommer odlingsförhållanden att vara identiska under hela studien:

Odlingsmedium: standardiserad produkt (att specificeras i slutligt protokoll) Inkubatortyp: identisk för båda armarna (time-lapse föredragen) Gasatmosfär: standardiserad CO₂/O₂/N₂-sammansättning Morfologiska bedömningar vid: dag 1 (fertiliseringskontroll), dag 3, dag 4 (randomisering), dag 5, dag 6 Blastocystpoängsättning: Gardner-graderingssystem (expansion, ICM-grad, TE-grad)

UTFALLSMÅTT

Primärt utfall:

Frekvens av användbara blastocyster (Gardner-poäng ≥3BB) per embryo inkluderat i studien, bedömd vid dag 5 och dag 6 av in vitro-odling (tidsram: 6 dagar från fertilisering).

Sekundära utfall (med tidsramar):

Total blastocystutvecklingsfrekvens (D5 + D6 kombinerat) – tidsram: dag 6 Fördelning av Gardner-poäng bland erhållna blastocyster – tidsram: dag 6 Blastocystkryopreserveringsfrekvens – tidsram: dag 6–7 Implantationsfrekvens (graviditetssäck per överförd blastocyst) – tidsram: 5 veckor post-överföring Klinisk graviditetsfrekvens (fostrahjärtslag detekterat vid ultraljud vid 7 veckor) – tidsram: 7 veckor post-överföring Pågående graviditetsfrekvens (livskraftig graviditet bortom 12 veckors graviditet) – tidsram: 12 veckor post-överföring Levandefödselfrekvens per embryoöverföring – tidsram: cirka 9 månader post-överföring Morfokinetisk analys (om time-lapse-inkubator tillgänglig för båda armarna) – tidsram: dag 6 Aneuploidifrekvens i embryon som genomgår PGT-A (exploratorisk slutpunkt) – tidsram: dag 5–6 (biopsi) plus laboratorieomloppstid

STATISTISK ANALYSPLAN

Stickprovsstorleksberäkning:

Stickprovsstorleken baseras på det primära slutpunkten (frekvens av användbara blastocyster ≥3BB per embryo).
Antagande om en blastocystfrekvens på 42 % i kontrollgruppen och 57 % i interventionsgruppen (absolut skillnad på 15 %), med 80 % styrka, tvåsidig α = 0,05, med chi-två-test med Fleiss kontinuitetskorrektion:

N per arm ≈ 100–110 patienter Med 15 % bortfallskorrigering: N per arm ≈ 115–130 patienter Total uppskattad stickprovsstorlek: N ≈ 230–260 patienter

Stickprovsstorleksberäkningen kommer att uppdateras med definitiva preliminära data från centret före slutlig registrering.
Statistisk konsultation med en biostatistiker kommer att erhållas före start av inkludering.

Primäranalys:

Frekvensen av användbara blastocyster kommer att jämföras mellan de två armarna med chi-två-test (eller Fishers exakta test för små stickprov).
Den primära analysen kommer att följa intention-to-treat (ITT)-principen, inklusive alla randomiserade patienter oavsett protokollavvikelser.

Sekundäranalyser:

Multivariabel logistisk regression med justering för fördefinierade kovariater (patientålder, fragmenteringsgrad, operatör, inkubatortyp) Fördefinierade undergruppsanalyser: ålder <35 mot. ≥35 år; fragmenteringsgrad (10–25 % mot. 26–50 %); inkubatortyp (time-lapse mot. konventionell) Per-protokoll (PP)-analys som en sensitivitetsanalys Kaplan-Meier-överlevnadsanalys för pågående graviditet och levandefödelseutfall

Interimanalys:

En förplanerad interimanalys kommer att genomföras vid 50 % inkludering (cirka N=120 patienter), granskad av en oberoende Data Safety Monitoring Board (DSMB).
Stoppregler kommer att följa O’Brien-Fleming-gränsen för effekt och fördefinierade kriterier för säkerhet.

Saknade data:

Saknade data för den primära slutpunkten kommer att hanteras med worst-case scenario-imputation.
För kliniska utfallsdata kommer multipel imputation att tillämpas för data saknade slumpmässigt.

DATAINSAMLING OCH HANTERING

Data kommer att samlas in prospektivt med ett standardiserat Case Report Form (CRF).
Nyckeldatadomäner inkluderar:

Baseline patientdata: ålder, BMI, FSH, AMH, antral follikelräkning (AFC), ART-indikation, antal tidigare cykler, stimuleringsprotokoll, antal hämtade och fertiliserade äggceller.

D4-laboratoriedata: antal bedömda embryon, antal med ≥10 % fragmentering, fragmenteringsgrad per embryo (%), morfodynamiskt stadium vid D4 (kompakterande morula, full morula, etc.), randomiseringsarm, defragmenteringsteknik (endast grupp A), procedurtid, operativa anteckningar.

D5/D6-laboratoriedata: antal blastocyster per dag, Gardner-poäng per blastocyst (bedömd av blindad embryolog), antal blastocyster kryopreserverade.

Kliniska utfallsdata: embryoöverföring utförd (ja/nej), antal överförda blastocyster, biokemisk graviditet (beta-hCG), klinisk graviditet (hjärtslag vid 7 veckor), pågående graviditet (12 veckor), levandefödsel.

All data kommer att pseudonymiseras.
Datahantering kommer att följa GDPR (EU-förordning 679/2016) och tillämplig italiensk dataskyddslagstiftning (D.Lgs. 196/2003).
Data kommer att lagras i en säker, åtkomstkontrollerad databas.

ETIK OCH REGULATORISK EFTERLEVNAD Studien har erhållit ett gynnsamt utlåtande från det lokala etikprövningsnämnden (Comitato Etico).
Alla patienter kommer att få ett detaljerat patientinformationsblad och kommer att lämna skriftligt informerat samtycke före någon studie-relaterad procedur.
Studiens samtycke är separat från standard IVF/ICSI-cykelsamtycke.

Studien kommer att registreras på ClinicalTrials.gov före inkludering av den första deltagaren, i enlighet med ICMJE-krav för klinisk studieregistrering.
Parallell registrering på ISRCTN (Europa) är också planerad.

Studien genomförs i enlighet med Helsingforsdeklarationen, ICH Good Clinical Practice (GCP)-riktlinjer och tillämpliga italienska och europeiska regulatoriska krav.

STUDIETIDSLINJE (UPPSKATTAD)

Protokollfinalisering och teamutbildning: 1 månad ClinicalTrials.gov och ISRCTN-registrering: 2 veckor Inledningsfas (procedurkalibrering och intern revision): 1 månad Aktiv inkludering: 6 månader Interim DSMB-analys: månad 6 Klinisk uppföljning (pågående graviditet och levandefödsel): 6 månader post-inkludering Slutlig statistisk analys: 1 månad Manusförberedelse och inlämning: 1 månad Total uppskattad varaktighet: ~20 månader