День-4 Дефрагментация Эмбриона: Частота Бластоцист и Клинические Исходы (DEBRIS)

ОБОСНОВАНИЕ И НАУЧНАЯ РАЦИОНАЛЬНОСТЬ Фрагментация эмбрионов является одной из наиболее часто наблюдаемых морфологических аномалий во время культивирования in vitro в вспомогательных репродуктивных технологиях (ВРТ). Безъядерные цитоплазматические фрагменты возникают в результате асимметричного клеточного деления или апоптотических процессов и могут занимать различную долю объема эмбриона. Их присутствие последовательно ассоциируется со сниженным имплантационным потенциалом, более низкими показателями образования бластоцист и худшими клиническими исходами в циклах ЭКО/ИКСИ.

Современные системы оценки эмбрионов, включая Стамбульский консенсус и систему оценки бластоцист по Гарднеру, учитывают фрагментацию как ключевой морфологический параметр. Эмбрионы с фрагментацией ≥10% на стадиях дробления обычно считаются имеющими сниженный, но не отсутствующий, потенциал развития, и их ведение — в частности, вопрос о том, является ли активное вмешательство по удалению фрагментов полезным — остается предметом продолжающихся дискуссий.

Механическая и лазерная дефрагментация эмбрионов на ранних стадиях дробления (день 2–день 3) практикуется в отдельных лабораториях ВРТ на протяжении нескольких десятилетий. Рациональность заключается в том, что физическое удаление безъядерных фрагментов может снять ограничения развития с бластомеров, уменьшить цитотоксические или апоптотические сигналы и улучшить компактизацию и образование бластоцист. Однако опубликованные данные о ранней дефрагментации неоднородны: некоторые исследования сообщают об улучшении развития бластоцист и показателей беременности, в то время как другие не показывают значительной пользы или даже указывают на потенциальный вред из-за механического стресса во время манипуляции.

Критический пробел в литературе касается дефрагментации, выполняемой на 4-й день (D4) культивирования, что соответствует стадии морулы и ранней компактизации. К D4 эмбрионы, успешно сохранившие компетентность к развитию, проходят компактизацию — ключевое морфогенетическое событие, включающее поляризацию клеток, образование плотных контактов и формирование линий внутренней клеточной массы и трофэктодермы. Биологическое обоснование дефрагментации на D4 отличается от более ранних вмешательств: на этой стадии взаимосвязь между фрагментами и компактизирующимися бластомерами может быть более четко определена, и удаление фрагментов с меньшей вероятностью может нарушить текущее клеточное деление, потенциально поддерживая процесс компактизации.

Предварительные наблюдательные данные нашего центра позволяют предположить, что дефрагментация на D4 может быть связана с более высокими показателями пригодных бластоцист по сравнению с историческим контролем, особенно у эмбрионов с умеренной фрагментацией (10–50%). Эти предварительные выводы, хотя и обнадеживающие, были получены из нерандомизированных данных и подвержены влиянию селекционного смещения. Следовательно, необходимо проспективное рандомизированное контролируемое исследование (РКИ), чтобы определить, действительно ли дефрагментация на D4 улучшает исходы развития и клинические исходы.

ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ Это проспективное, рандомизированное, контролируемое, простое слепое исследование (испытание DEBRIS-D4 / DEFRAG-D4). Исследование разработано в соответствии с рекомендациями CONSORT по отчетности о рандомизированных испытаниях и следует контрольному списку SPIRIT для протоколов клинических испытаний.

Простое слепое исследование: Эмбриолог, оценивающий качество бластоцист на D5/D6, и сонограф, оценивающий клиническую беременность, будут ослеплены относительно распределения в группы лечения. Ослепление эмбриолога, выполняющего процедуру на D4, невозможно из-за характера вмешательства.

Единица рандомизации: Рандомизация проводится на уровне пациента (а не на уровне эмбриона), чтобы избежать контаминации между группами и отразить клиническую реальность ведения когорты эмбрионов.

Факторы стратификации:

Возраст пациентки: <35 лет против ≥35 лет Количество эмбрионов с фрагментацией ≥10% на D4: 1–2 против ≥3 Использование преимплантационного генетического тестирования на анеуплоидию (ПГТ-А): да против нет

Метод рандомизации: Предварительно сгенерированные списки рандомизации с блоками переменного размера (4 и 6), управляемые через последовательно пронумерованные запечатанные непрозрачные конверты. Конверты вскрываются утром 4-го дня, после того как морфологическая оценка подтвердит наличие хотя бы одного эмбриона, соответствующего критериям включения.

ИССЛЕДУЕМАЯ ПОПУЛЯЦИЯ

Критерии включения:

Пациентки, проходящие циклы ЭКО/ИКСИ в участвующем центре Возраст 18–43 года Базальный ФСГ <20 мМЕ/мл Наличие ≥1 эмбриона с цитоплазматической фрагментацией ≥10% при морфологической оценке на D4 Эмбрионы, предназначенные для пролонгированного культивирования до стадии бластоцисты (D5/D6) Получено письменное информированное согласие до любой процедуры, связанной с исследованием

Критерии исключения:

Циклы с донорскими гаметами (донорство ооцитов или спермы) Циклы с преимплантационным генетическим тестированием на моногенные заболевания (ПГТ-М) в качестве основного показания Эмбрионы с диффузной фрагментацией >50% или тяжелыми морфологическими нарушениями на 3-й день Параллельное участие в других интервенционных исследованиях, которые могут повлиять на исходы данного исследования Неспособность предоставить информированное согласие

ВМЕШАТЕЛЬСТВА

Группа A — Дефрагментация на D4 (Вмешательство):

Механическая или лазерная дефрагментация будет выполняться на 4-й день (96 ± 2 часа после оплодотворения), сразу после утренней морфологической оценки. Все эмбрионы пациенток, рандомизированных в Группу A, с фрагментацией ≥10% пройдут процедуру.

Процедура дефрагментации будет проводиться в стандартных условиях микроманипуляции:

Среда с низкой освещенностью Контролируемая температура 37°C (подогреваемый столик) Максимальное время вне инкубатора на одну пациентку: ≤10 минут Техника: механическая дефрагментация с использованием биопсийной пипетки или лазерное удаление (в соответствии со стандартной операционной процедурой конкретного центра) После дефрагментации эмбрионы будут возвращены в культуру в тех же стандартных условиях (инкубатор с покадровой съемкой или обычный инкубатор, в зависимости от ситуации)

Группа B — Стандартное культивирование (Контроль):

Эмбрионы в контрольной группе не будут подвергаться дополнительным манипуляциям, кроме рутинной морфологической оценки на D4. Чтобы обеспечить сопоставимость условий культивирования между группами, оценка на D4 у пациенток контрольной группы будет проводиться тем же оператором и с той же продолжительностью открытия инкубатора, что и в группе вмешательства (т.е. эмбрионы будут кратковременно извлечены для оценки, но немедленно возвращены без вмешательства).

Стандартизация лабораторных условий:

Для обеих групп условия культивирования будут идентичными на протяжении всего исследования:

Культуральная среда: стандартизированный продукт (будет указан в окончательном протоколе) Тип инкубатора: одинаковый для обеих групп (предпочтительно с покадровой съемкой) Газовая атмосфера: стандартизированный состав CO₂/O₂/N₂ Морфологические оценки на: день 1 (проверка оплодотворения), день 3, день 4 (рандомизация), день 5, день 6 Оценка бластоцист: система Гарднера (экспансия, оценка ВКМ, оценка ТЭ)

КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ РЕЗУЛЬТАТОВ

Первичный исход:

Показатель пригодных бластоцист (оценка по Гарднеру ≥3BB) на один эмбрион, включенный в исследование, оцененный на 5-й и 6-й день культивирования in vitro (временные рамки: 6 дней с момента оплодотворения).

Вторичные исходы (с временными рамками):

Общий показатель развития бластоцист (D5 + D6 комбинированно) — временные рамки: день 6 Распределение оценок по Гарднеру среди полученных бластоцист — временные рамки: день 6 Показатель криоконсервации бластоцист — временные рамки: день 6–7 Показатель имплантации (гестационный мешок на пересаженную бластоцисту) — временные рамки: 5 недель после переноса Показатель клинической беременности (сердцебиение плода, обнаруженное на УЗИ в 7 недель) — временные рамки: 7 недель после переноса Показатель прогрессирующей беременности (жизнеспособная беременность после 12 недель гестации) — временные рамки: 12 недель после переноса Показатель живорождений на перенос эмбриона — временные рамки: примерно 9 месяцев после переноса Анализ морфокинетики (если инкубатор с покадровой съемкой доступен для обеих групп) — временные рамки: день 6 Показатель анеуплоидии у эмбрионов, проходящих ПГТ-А (исследовательская конечная точка) — временные рамки: день 5–6 (биопсия) плюс время обработки в лаборатории

ПЛАН СТАТИСТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

Расчет размера выборки:

Размер выборки основан на первичной конечной точке (показатель пригодных бластоцист ≥3BB на эмбрион). Предполагая показатель бластоцист 42% в контрольной группе и 57% в группе вмешательства (абсолютная разница 15%), с мощностью 80%, двусторонний α = 0,05, используя критерий хи-квадрат с поправкой Флейсса:

N на группу ≈ 100–110 пациенток С поправкой на 15% выбывших: N на группу ≈ 115–130 пациенток Общий предполагаемый размер выборки: N ≈ 230–260 пациенток

Расчет размера выборки будет обновлен с окончательными предварительными данными центра до окончательной регистрации. Консультация с биостатистиком будет получена до начала набора.

Первичный анализ:

Показатель пригодных бластоцист будет сравниваться между двумя группами с использованием критерия хи-квадрат (или точного критерия Фишера для малых выборок). Первичный анализ будет следовать принципу «по намерению лечить» (ITT), включая всех рандомизированных пациенток независимо от отклонений от протокола.

Вторичные анализы:

Многомерная логистическая регрессия с поправкой на заранее заданные ковариаты (возраст пациентки, степень фрагментации, оператор, тип инкубатора) Заранее запланированные анализы подгрупп: возраст <35 лет против ≥35 лет; степень фрагментации (10–25% против 26–50%); тип инкубатора (с покадровой съемкой против обычного) Анализ «в соответствии с протоколом» (PP) в качестве анализа чувствительности Анализ выживаемости по Каплану-Мейеру для исходов прогрессирующей беременности и живорождения

Промежуточный анализ:

Запланированный промежуточный анализ будет проведен при наборе 50% (примерно N=120 пациенток), рассмотрен независимым Комитетом по мониторингу безопасности данных (КМБД). Правила остановки будут следовать границе О’Брайена-Флеминга для эффективности и заранее установленным критериям безопасности.

Пропущенные данные:

Пропущенные данные для первичной конечной точки будут обрабатываться с использованием импутации по наихудшему сценарию. Для данных клинических исходов будет применяться множественная импутация для данных, пропущенных случайным образом.

СБОР И УПРАВЛЕНИЕ ДАННЫМИ

Данные будут собираться проспективно с использованием стандартизированной Карты наблюдения за пациентом (КНП). Ключевые области данных включают:

Исходные данные пациентки: возраст, ИМТ, ФСГ, АМГ, количество антральных фолликулов (АФК), показания к ВРТ, количество предыдущих циклов, протокол стимуляции, количество полученных и оплодотворенных ооцитов.

Лабораторные данные D4: количество оцененных эмбрионов, количество с фрагментацией ≥10%, степень фрагментации на эмбрион (%), морфодинамическая стадия на D4 (компактизирующаяся морула, полная морула и т.д.), группа рандомизации, техника дефрагментации (только Группа A), продолжительность процедуры, операционные заметки.

Лабораторные данные D5/D6: количество бластоцист по дням, оценка по Гарднеру на бластоцисту (оценено ослепленным эмбриологом), количество криоконсервированных бластоцист.

Данные клинических исходов: выполнен ли перенос эмбриона (да/нет), количество перенесенных бластоцист, биохимическая беременность (бета-ХГЧ), клиническая беременность (сердцебиение в 7 недель), прогрессирующая беременность (12 недель), живорождение.

Все данные будут псевдонимизированы. Управление данными будет соответствовать GDPR (Регламент ЕС 679/2016) и применимому итальянскому законодательству о защите данных (D.Lgs. 196/2003). Данные будут храниться в защищенной базе данных с контролируемым доступом.

ЭТИКА И СОБЛЮДЕНИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ ТРЕБОВАНИЙ Исследование получило положительное заключение местного Этического комитета (Comitato Etico). Все пациентки получат подробный информационный лист для пациентов и предоставят письменное информированное согласие до любой процедуры, связанной с исследованием. Согласие на исследование отделено от стандартного согласия на цикл ЭКО/ИКСИ.

Исследование будет зарегистрировано на ClinicalTrials.gov до включения первого участника, в соответствии с требованиями ICMJE по регистрации клинических испытаний. Также планируется параллельная регистрация на ISRCTN (Европа).

Исследование проводится в соответствии с Хельсинкской декларацией, рекомендациями ICH по надлежащей клинической практике (GCP) и применимыми итальянскими и европейскими регуляторными требованиями.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЙ ГРАФИК ИССЛЕДОВАНИЯ (ОЦЕНОЧНЫЙ)

Завершение протокола и обучение команды: 1 месяц Регистрация на ClinicalTrials.gov и ISRCTN: 2 недели Вводный этап (калибровка процедуры и внутренний аудит): 1 месяц Активный набор: 6 месяцев Промежуточный анализ КМБД: месяц 6 Клиническое наблюдение (прогрессирующая беременность и живорождение): 6 месяцев после набора Окончательный статистический анализ: 1 месяц Подготовка и подача рукописи: 1 месяц Общая предполагаемая продолжительность: ~20 месяцев