Desfragmentação do Embrião do Dia 4: Taxa de Blastocisto e Resultados Clínicos (DEBRIS)

FUNDAMENTAÇÃO E RAZÃO CIENTÍFICA A fragmentação embrionária é uma das anomalias morfológicas mais frequentemente observadas durante a cultura in vitro em tecnologia de reprodução assistida (TRA). Fragmentos citoplasmáticos anucleados surgem de divisão celular assimétrica ou processos apoptóticos e podem afetar uma proporção variável do volume do embrião. A sua presença tem sido consistentemente associada a um potencial de implantação reduzido, taxas mais baixas de formação de blastocisto e resultados clínicos mais fracos em ciclos de FIV/ICSI.

Os sistemas atuais de classificação embrionária, incluindo o Consenso de Istambul e o sistema de pontuação de Gardner para blastocistos, incorporam a fragmentação como um parâmetro morfológico chave. Embriões com fragmentação ≥10% em estádios de clivagem são geralmente considerados como tendo um potencial de desenvolvimento reduzido, mas não ausente, e a sua gestão - particularmente se a intervenção ativa para remover fragmentos é benéfica - permanece um tema de debate contínuo.

A defragmentação embrionária mecânica e assistida por laser em estádios iniciais de clivagem (Dia 2-Dia 3) tem sido praticada em laboratórios de TRA selecionados há várias décadas. A razão é que a remoção física de fragmentos anucleados pode aliviar restrições de desenvolvimento nos blastómeros, reduzir sinalização citotóxica ou apoptótica e melhorar a compactação e formação de blastocisto. No entanto, a evidência publicada sobre defragmentação precoce é heterogénea: alguns estudos relatam melhorias no desenvolvimento do blastocisto e taxas de gravidez, enquanto outros não mostram benefício significativo ou mesmo dano potencial devido ao stress mecânico durante a manipulação.

Uma lacuna crítica na literatura diz respeito à defragmentação realizada no Dia 4 (D4) de cultura, correspondendo ao estádio de mórula e compactação precoce. No D4, embriões que mantiveram com sucesso competência de desenvolvimento estão a sofrer compactação - um evento morfogenético chave envolvendo polarização celular, formação de junções apertadas e estabelecimento das linhagens da massa celular interna e do trofectoderme. A razão biológica para a defragmentação no D4 difere de intervenções mais precoces: nesta fase, a relação entre fragmentos e blastómeros em compactação pode estar mais claramente definida, e a remoção de fragmentos pode interferir menos com a divisão celular em curso enquanto potencialmente suporta o processo de compactação.

Dados observacionais preliminares do nosso centro sugerem que a defragmentação no D4 pode estar associada a taxas mais altas de blastocistos utilizáveis em comparação com controlos históricos, particularmente em embriões com fragmentação moderada (10-50%). Estes achados preliminares, embora encorajadores, foram obtidos a partir de dados não randomizados e estão sujeitos a viés de seleção. Um ensaio clínico randomizado e controlado (ECR) prospetivo é, portanto, necessário para determinar se a defragmentação no D4 genuinamente melhora os resultados de desenvolvimento e clínicos.

DESENHO DO ESTUDO Este é um ensaio prospetivo, randomizado, controlado, de simples cegueira (ensaio DEBRIS-D4 / DEFRAG-D4). O estudo é desenhado de acordo com as diretrizes CONSORT para relato de ensaios randomizados e segue a lista de verificação SPIRIT para protocolos de ensaios clínicos.

Desenho de simples cegueira: O embriologista que realiza a avaliação da qualidade do blastocisto no D5/D6 e o ecografista que avalia a gravidez clínica estarão cegados para a atribuição do braço de tratamento. O cegamento do embriologista que realiza o procedimento no D4 não é viável devido à natureza da intervenção.

Unidade de randomização: A randomização ocorre ao nível do paciente (não ao nível do embrião), para evitar contaminação entre grupos e refletir a realidade clínica da gestão de coortes embrionárias.

Fatores de estratificação:

Idade do paciente: <35 anos vs. ≥35 anos Número de embriões com fragmentação ≥10% no D4: 1-2 vs. ≥3 Uso de teste genético pré-implantacional para aneuploidias (PGT-A): sim vs. não

Método de randomização: Listas de randomização por blocos pré-geradas com tamanhos de bloco variáveis (4 e 6), geridas através de envelopes opacos selados numerados sequencialmente. Os envelopes são abertos na manhã do Dia 4, após a avaliação morfológica confirmar a presença de pelo menos um embrião que preenche os critérios de inclusão.

POPULAÇÃO DO ESTUDO

Critérios de Inclusão:

Pacientes do sexo feminino submetidas a ciclos de FIV/ICSI no centro participante Idade 18-43 anos FSH basal < 20 mUI/mL Presença de ≥1 embrião com fragmentação citoplasmática ≥10% na avaliação morfológica do D4 Embriões destinados a cultura prolongada até estádio de blastocisto (D5/D6) Consentimento informado escrito obtido antes de qualquer procedimento relacionado com o estudo

Critérios de Exclusão:

Ciclos com gâmetas de dador (doação de ovócitos ou esperma) Ciclos com teste genético pré-implantacional para doença monogénica (PGT-M) como indicação primária Embriões com fragmentação difusa >50% ou compromisso morfológico grave no Dia 3 Participação simultânea noutros estudos intervencionistas que possam interferir com os resultados do estudo Incapacidade de fornecer consentimento informado

INTERVENÇÕES

Grupo A - Defragmentação no D4 (Intervenção):

A defragmentação mecânica ou assistida por laser será realizada no Dia 4 (96 ± 2 horas pós-fertilização), imediatamente após a avaliação morfológica da manhã. Todos os embriões pertencentes a pacientes randomizadas para o Grupo A com fragmentação ≥10% serão submetidos ao procedimento.

O procedimento de defragmentação será realizado em condições padrão de micromanipulação:

Ambiente com exposição luminosa baixa Temperatura controlada a 37°C (plataforma aquecida) Tempo máximo fora da incubadora por paciente: ≤10 minutos Técnica: defragmentação mecânica usando uma pipeta de biópsia ou remoção assistida por laser (conforme procedimento operacional padrão específico do centro) Após defragmentação, os embriões serão devolvidos à cultura nas mesmas condições padrão (incubadora de time-lapse ou incubadora convencional, conforme aplicável)

Grupo B - Cultura Padrão (Controlo):

Os embriões no braço de controlo não receberão qualquer manipulação adicional para além da avaliação morfológica de rotina no D4. Para garantir comparabilidade das condições de cultura entre grupos, a avaliação do D4 em pacientes controlo será realizada pelo mesmo operador com a mesma duração de abertura da incubadora que no grupo de intervenção (ou seja, os embriões serão brevemente removidos para avaliação mas imediatamente devolvidos sem intervenção).

Padronização Laboratorial:

Para ambos os braços, as condições de cultura serão idênticas durante todo o estudo:

Meio de cultura: produto padronizado (a especificar no protocolo final) Tipo de incubadora: idêntico para ambos os braços (preferencialmente time-lapse) Atmosfera gasosa: composição padronizada de CO₂/O₂/N₂ Avaliações morfológicas em: Dia 1 (verificação de fertilização), Dia 3, Dia 4 (randomização), Dia 5, Dia 6 Pontuação de blastocisto: sistema de classificação de Gardner (expansão, grau de MCI, grau de TE)

MEDIDAS DE RESULTADO

Resultado Primário:

Taxa de blastocistos utilizáveis (pontuação de Gardner ≥3BB) por embrião incluído no estudo, avaliada no Dia 5 e Dia 6 de cultura in vitro (período de tempo: 6 dias desde a fertilização).

Resultados Secundários (com períodos de tempo):

Taxa global de desenvolvimento de blastocisto (D5 + D6 combinados) - período de tempo: Dia 6 Distribuição de pontuações de Gardner entre blastocistos obtidos - período de tempo: Dia 6 Taxa de criopreservação de blastocisto - período de tempo: Dia 6-7 Taxa de implantação (saco gestacional por blastocisto transferido) - período de tempo: 5 semanas pós-transferência Taxa de gravidez clínica (batimento cardíaco fetal detetado na ecografia às 7 semanas) - período de tempo: 7 semanas pós-transferência Taxa de gravidez em curso (gravidez viável para além das 12 semanas de gestação) - período de tempo: 12 semanas pós-transferência Taxa de nascimento vivo por transferência embrionária - período de tempo: aproximadamente 9 meses pós-transferência Análise morfocinética (se incubadora de time-lapse disponível para ambos os braços) - período de tempo: Dia 6 Taxa de aneuploidia em embriões submetidos a PGT-A (endpoint exploratório) - período de tempo: Dia 5-6 (biópsia) mais tempo de processamento laboratorial

PLANO DE ANÁLISE ESTATÍSTICA

Cálculo do Tamanho da Amostra:

O tamanho da amostra baseia-se no endpoint primário (taxa de blastocistos utilizáveis ≥3BB por embrião). Assumindo uma taxa de blastocisto de 42% no grupo controlo e 57% no grupo de intervenção (diferença absoluta de 15%), com 80% de poder, α bicaudal = 0,05, usando o teste do qui-quadrado com correção de continuidade de Fleiss:

N por braço ≈ 100-110 pacientes Com correção de 15% para desistências: N por braço ≈ 115-130 pacientes Tamanho total estimado da amostra: N ≈ 230-260 pacientes

O cálculo do tamanho da amostra será atualizado com dados preliminares definitivos do centro antes do registo final. Será obtida consulta estatística com um bioestatístico antes do início do recrutamento.

Análise Primária:

A taxa de blastocistos utilizáveis será comparada entre os dois braços usando o teste do qui-quadrado (ou teste exato de Fisher para amostras pequenas). A análise primária seguirá o princípio de Intenção-de-Tratar (ITT), incluindo todos os pacientes randomizados independentemente de desvios do protocolo.

Análises Secundárias:

Regressão logística multivariável ajustando para covariáveis pré-especificadas (idade do paciente, grau de fragmentação, operador, tipo de incubadora) Análises de subgrupo pré-especificadas: idade <35 vs. ≥35 anos; grau de fragmentação (10-25% vs. 26-50%); tipo de incubadora (time-lapse vs. convencional) Análise por protocolo (PP) como análise de sensibilidade Análise de sobrevivência de Kaplan-Meier para resultados de gravidez em curso e nascimento vivo

Análise Intermédia:

Uma análise intermédia pré-planeada será conduzida a 50% do recrutamento (aproximadamente N=120 pacientes), revista por um Conselho de Monitorização de Segurança de Dados (DSMB) independente. As regras de parada seguirão o limite de O'Brien-Fleming para eficácia e critérios pré-especificados para segurança.

Dados em Falta:

Dados em falta para o endpoint primário serão tratados usando imputação do pior cenário. Para dados de resultado clínico, será aplicada imputação múltipla para dados em falta ao acaso.

COLETA E GESTÃO DE DADOS

Os dados serão recolhidos prospetivamente usando um Formulário de Relato de Caso (CRF) padronizado. Domínios de dados chave incluem:

Dados basais do paciente: idade, IMC, FSH, AMH, contagem de folículos antrais (AFC), indicação de TRA, número de ciclos anteriores, protocolo de estimulação, número de ovócitos recolhidos e fertilizados.

Dados laboratoriais do D4: número de embriões avaliados, número com fragmentação ≥10%, grau de fragmentação por embrião (%), estádio morfodinâmico no D4 (mórula em compactação, mórula completa, etc.), braço de randomização, técnica de defragmentação (apenas Grupo A), duração do procedimento, notas operativas.

Dados laboratoriais do D5/D6: número de blastocistos por dia, pontuação de Gardner por blastocisto (avaliada por embriologista cegado), número de blastocistos criopreservados.

Dados de resultado clínico: transferência embrionária realizada (sim/não), número de blastocistos transferidos, gravidez bioquímica (beta-hCG), gravidez clínica (batimento cardíaco às 7 semanas), gravidez em curso (12 semanas), nascimento vivo.

Todos os dados serão pseudonimizados. A gestão de dados cumprirá o RGPD (Regulamento UE 679/2016) e a legislação italiana aplicável de proteção de dados (D.Lgs. 196/2003). Os dados serão armazenados numa base de dados segura com controlo de acesso.

ÉTICA E CONFORMIDADE REGULAMENTAR O estudo obteve um parecer favorável do Comité de Ética local (Comitato Etico). Todos os pacientes receberão uma folha de informação detalhada e fornecerão consentimento informado escrito antes de qualquer procedimento relacionado com o estudo. O consentimento do estudo é separado do consentimento padrão do ciclo de FIV/ICSI.

O estudo será registado no ClinicalTrials.gov antes do recrutamento do primeiro participante, de acordo com os requisitos ICMJE para registo de ensaios clínicos. Também está planeado registo paralelo no ISRCTN (Europa).

O estudo é conduzido de acordo com a Declaração de Helsínquia, as diretrizes de Boas Práticas Clínicas (GCP) do ICH e os requisitos regulamentares italianos e europeus aplicáveis.

CRONOGRAMA DO ESTUDO (ESTIMADO)

Finalização do protocolo e formação da equipa: 1 mês Registo no ClinicalTrials.gov e ISRCTN: 2 semanas Fase de arranque (calibração do procedimento e auditoria interna): 1 mês Recrutamento ativo: 6 meses Análise intermédia do DSMB: Mês 6 Seguimento clínico (gravidez em curso e nascimento vivo): 6 meses pós-recrutamento Análise estatística final: 1 mês Preparação e submissão do manuscrito: 1 mês Duração total estimada: ~20 meses