Dag-4 embryo defragmentering: Blastocystrate og kliniske utfall (DEBRIS)

BAKGRUNN OG VITENSKAPELIG RASJONALE Embryofragmentering er en av de hyppigst observerte morfologiske unormalitetene under in vitro-kultivering i assistert reproduksjonsteknologi (ART). Anukleære cytoplasmatiske fragmenter oppstår fra asymmetrisk celledeling eller apoptotiske prosesser og kan påvirke en varierende andel av embryoets volum. Deres tilstedeværelse har konsekvent vært assosiert med redusert implantasjonspotensial, lavere blastocystdannelsesrater og dårligere kliniske resultater i IVF/ICSI-sykler.

Nåværende embryograderingssystemer, inkludert Istanbul-konsensusen og Gardner-scoringssystemet for blastocyster, inkorporerer fragmentering som en sentral morfologisk parameter. Embryoer med fragmentering ≥10% ved kløyvningsstadier anses generelt for å ha et redusert, men ikke fraværende, utviklingspotensial, og deres håndtering – spesielt om aktiv intervensjon for å fjerne fragmenter er fordelaktig – forblir et tema for pågående debatt.

Mekanisk og laserassistert embryo-defragmentering ved tidlige kløyvningsstadier (dag 2–dag 3) har blitt praktisert i utvalgte ART-laboratorier i flere tiår. Rasjonale er at fysisk fjerning av anukleære fragmenter kan lindre utviklingsmessige begrensninger på blastomerer, redusere cytotoksisk eller apoptotisk signalering og forbedre kompaksjon og blastocystdannelse. Imidlertid er publisert bevis for tidlig defragmentering heterogent: noen studier rapporterer forbedringer i blastocystutvikling og svangerskapsrater, mens andre ikke viser noen signifikant fordel eller til og med potensiell skade på grunn av mekanisk stress under manipulasjon.

Et kritisk gap i litteraturen gjelder defragmentering utført på dag 4 (D4) av kultivering, tilsvarende morula- og tidlig kompaksjonsstadium. Ved D4 gjennomgår embryoer som har opprettholdt utviklingskompetanse, kompaksjon – en sentral morfogenetisk hendelse som involverer cellpolarisering, tight junction-dannelse og etablering av indre cellemasse- og trofektoderm-linjer. Den biologiske rasjonalen for D4-defragmentering skiller seg fra tidligere intervensjoner: på dette stadiet kan forholdet mellom fragmenter og kompakterende blastomerer være tydeligere definert, og fjerning av fragmenter kan mindre sannsynlig forstyrre pågående celledeling samtidig som den potensielt støtter kompaksjonsprosessen.

Foreløpige observasjonsdata fra vårt senter antyder at D4-defragmentering kan være assosiert med høyere rater av brukbare blastocyster sammenlignet med historiske kontroller, spesielt i embryoer med moderat fragmentering (10–50%). Disse foreløpige funnene, selv om de er oppmuntrende, ble hentet fra ikke-randomiserte data og er utsatt for seleksjonsbias. En prospektiv randomisert kontrollert studie (RCT) er derfor nødvendig for å fastslå om D4-defragmentering genuint forbedrer utviklingsmessige og kliniske utfall.

STUDIEDESIGN Dette er en prospektiv, randomisert, kontrollert, enkelblindet studie (DEBRIS-D4 / DEFRAG-D4-studien). Studien er designet i henhold til CONSORT-retningslinjer for rapportering av randomiserte studier og følger SPIRIT-sjekklisten for kliniske studieprotokoller.

Enkelblindet design: Embryologen som utfører blastocystkvalitetsvurdering på D5/D6 og sonografen som evaluerer klinisk svangerskap vil være blindet for behandlingsarmtilordningen. Blinding av embryologen som utfører D4-prosedyren er ikke mulig på grunn av intervensjonens natur.

Randomiseringsenhet: Randomisering skjer på pasientnivå (ikke embryonivå), for å unngå kontaminering mellom grupper og for å reflektere den kliniske virkeligheten av embryokohorthåndtering.

Stratifiseringsfaktorer:

Pasientalder: <35 år vs. ≥35 år Antall embryoer med ≥10% fragmentering på D4: 1–2 vs. ≥3 Bruk av preimplantasjonsgenetisk testing for aneuploidi (PGT-A): ja vs. nei

Randomiseringsmetode: Forhåndsgenererte blokkrandomiseringslister med variable blokkstørrelser (4 og 6), administrert gjennom sekvensielt nummererte forseglede ugjennomsiktige konvolutter. Konvolutter åpnes på morgenen dag 4, etter at morfologisk evaluering bekrefter tilstedeværelsen av minst ett embryo som oppfyller inklusjonskriterier.

STUDIEPOPULASJON

Inklusjonskriterier:

Kvinnelige pasienter som gjennomgår IVF/ICSI-sykler ved det deltakende senteret Alder 18–43 år Basal FSH < 20 mIU/mL Tilstedeværelse av ≥1 embryo med ≥10% cytoplasmatisk fragmentering ved D4 morfologisk evaluering Embryoer beregnet på utvidet kultivering til blastocyststadium (D5/D6) Skriftlig informert samtykke innhentet før enhver studierelatert prosedyre

Eksklusjonskriterier:

Donorgametsykler (egg- eller sæddonasjon) Sykler med preimplantasjonsgenetisk testing for monogen sykdom (PGT-M) som primær indikasjon Embryoer med diffus fragmentering >50% eller alvorlig morfologisk kompromittering på dag 3 Samtidig deltakelse i andre intervensjonsstudier som kan forstyrre studieutfall Manglende evne til å gi informert samtykke

INTERVENSJONER

Gruppe A – D4-defragmentering (intervensjon):

Mekanisk eller laserassistert defragmentering vil bli utført på dag 4 (96 ± 2 timer post-fertilisering), umiddelbart etter morgenens morfologiske vurdering. Alle embryoer som tilhører pasienter randomisert til Gruppe A med ≥10% fragmentering vil gjennomgå prosedyren.

Defragmenteringsprosedyren vil bli utført under standard mikromanipulasjonsforhold:

Lav lyseksponeringsmiljø Kontrollert temperatur på 37°C (oppvarmet scene) Maksimal tid utenfor inkubatoren per pasient: ≤10 minutter Teknikk: mekanisk defragmentering ved bruk av biopsipipette eller laserassistert fjerning (i henhold til senterspesifikk standard operasjonsprosedyre) Etter defragmentering vil embryoene returneres til kultivering under de samme standardforholdene (time-lapse-inkubator eller konvensjonell inkubator, etter gjeldende)

Gruppe B – Standardkultivering (kontroll):

Embryoer i kontrollarmen vil ikke motta noen ekstra manipulasjon utover rutinemessig morfologisk vurdering på D4. For å sikre sammenlignbarhet av kultiveringsforhold mellom grupper, vil D4-vurderingen hos kontrollpasienter bli utført av samme operatør med samme varighet av inkubatoråpning som i intervensjonsgruppen (dvs. embryoer vil bli kortvarig fjernet for evaluering, men umiddelbart returnert uten intervensjon).

Laboratoriestandardisering:

For begge armer vil kultiveringsforhold være identiske gjennom hele studien:

Kulturmedium: standardisert produkt (spesifiseres i endelig protokoll) Inkubatortype: identisk for begge armer (time-lapse foretrukket) Gassatmosfære: standardisert CO₂/O₂/N₂-sammensetning Morfologiske vurderinger på: dag 1 (befruktningssjekk), dag 3, dag 4 (randomisering), dag 5, dag 6 Blastocystscoring: Gardner-graderingssystem (ekspansjon, ICM-grad, TE-grad)

UTFALLSMÅL

Primært utfall:

Rate av brukbare blastocyster (Gardner-score ≥3BB) per embryo inkludert i studien, vurdert på dag 5 og dag 6 av in vitro-kultivering (tidsramme: 6 dager fra befruktning).

Sekundære utfall (med tidsrammer):

Total blastocystutviklingsrate (D5 + D6 kombinert) – tidsramme: dag 6 Distribusjon av Gardner-scorer blant oppnådde blastocyster – tidsramme: dag 6 Blastocystkryopreserveringsrate – tidsramme: dag 6–7 Implantasjonsrate (svangerskapssesk per blastocyst overført) – tidsramme: 5 uker post-overføring Klinisk svangerskapsrate (fosterhjerte påvist ved ultralyd ved 7 uker) – tidsramme: 7 uker post-overføring Pågående svangerskapsrate (levende svangerskap utover 12 svangerskapsuker) – tidsramme: 12 uker post-overføring Levendefødselsrate per embryooverføring – tidsramme: omtrent 9 måneder post-overføring Morfokinetisk analyse (hvis time-lapse-inkubator tilgjengelig for begge armer) – tidsramme: dag 6 Aneuploidirate i embryoer som gjennomgår PGT-A (utforskende endepunkt) – tidsramme: dag 5–6 (biopsi) pluss laboratorieomsetningstid

STATISTISK ANALYSEPLAN

Stikkprøvestørrelseberegning:

Stikkprøvestørrelsen er basert på det primære endepunktet (rate av brukbare blastocyster ≥3BB per embryo). Forutsatt en blastocystrate på 42 % i kontrollgruppen og 57 % i intervensjonsgruppen (absolutt forskjell på 15 %), med 80 % styrke, tosidig α = 0,05, ved bruk av chi-kvadrat-testen med Fleiss-kontinuitetskorreksjon:

N per arm ≈ 100–110 pasienter Med 15 % frafallskorreksjon: N per arm ≈ 115–130 pasienter Total estimert stikkprøve: N ≈ 230–260 pasienter

Stikkprøvestørrelseberegningen vil bli oppdatert med endelige foreløpige data fra senteret før endelig registrering. Statistisk konsultasjon med en biostatistiker vil bli innhentet før starten av inkludering.

Primæranalyse:

Raten av brukbare blastocyster vil bli sammenlignet mellom de to armene ved bruk av chi-kvadrat-testen (eller Fishers eksakte test for små utvalg). Den primære analysen vil følge intensjon-til-behandling (ITT)-prinsippet, inkludert alle randomiserte pasienter uavhengig av protokollavvik.

Sekundæranalyser:

Multivariabel logistisk regresjon justert for forhåndsspesifiserte kovariater (pasientalder, fragmenteringsgrad, operatør, inkubatortype) Forhåndsspesifiserte undergruppanalyser: alder <35 vs. ≥35 år; fragmenteringsgrad (10–25 % vs. 26–50 %); inkubatortype (time-lapse vs. konvensjonell) Per-protokoll (PP)-analyse som en sensitivitetsanalyse Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse for pågående svangerskap og levendefødselsutfall

Interimanalyse:

En planlagt interimanalyse vil bli utført ved 50 % inkludering (omtrent N=120 pasienter), gjennomgått av en uavhengig Data Safety Monitoring Board (DSMB). Stopperegler vil følge O'Brien-Fleming-grensen for effekt og forhåndsspesifiserte kriterier for sikkerhet.

Manglende data:

Manglende data for det primære endepunktet vil bli håndtert ved bruk av verste-tilfelle-imputering. For kliniske utfallsdata vil multiple imputering bli anvendt for data som mangler tilfeldig.

DATAINNSAMLING OG -HÅNDTERING

Data vil bli samlet inn prospektivt ved bruk av en standardisert Case Report Form (CRF). Nøkkeldatadomener inkluderer:

Baseline pasientdata: alder, BMI, FSH, AMH, antral follikkeltelling (AFC), ART-indikasjon, antall tidligere sykler, stimuleringsprotokoll, antall hentede og befruktede eggceller.

D4 laboratoriedata: antall embryoer vurdert, antall med ≥10 % fragmentering, fragmenteringsgrad per embryo (%), morfodynamisk stadium på D4 (kompakterende morula, full morula, etc.), randomiseringsarm, defragmenteringsteknikk (kun Gruppe A), prosedyrevarighet, operative notater.

D5/D6 laboratoriedata: antall blastocyster per dag, Gardner-score per blastocyst (vurdert av blindet embryolog), antall blastocyster kryopreservert.

Kliniske utfallsdata: embryooverføring utført (ja/nei), antall blastocyster overført, biokjemisk svangerskap (beta-hCG), klinisk svangerskap (hjerte på 7 uker), pågående svangerskap (12 uker), levendefødsel.

Alle data vil bli pseudonymisert. Datahåndtering vil overholde GDPR (EU-forordning 679/2016) og gjeldende italiensk databeskyttelseslovgivning (D.Lgs. 196/2003). Data vil bli lagret i en sikker, tilgangskontrollert database.

ETIKK OG REGULATORISK OVERHOLDELSE Studien har fått et gunstig uttalelse fra det lokale etikkomiteen (Comitato Etico). Alle pasienter vil motta et detaljert pasientinformasjonsark og vil gi skriftlig informert samtykke før enhver studierelatert prosedyre. Studiens samtykke er separat fra standard IVF/ICSI-syklus samtykke.

Studien vil bli registrert på ClinicalTrials.gov før inkludering av den første deltakeren, i henhold til ICMJE-krav for klinisk studieregistrering. Parallell registrering på ISRCTN (Europa) er også planlagt.

Studien utføres i samsvar med Helsingfors-erklæringen, ICH Good Clinical Practice (GCP)-retningslinjer og gjeldende italienske og europeiske regulatoriske krav.

STUDIETIDSPLAN (ESTIMERT)

Protokollfinalisering og teamtrening: 1 måned ClinicalTrials.gov og ISRCTN-registrering: 2 uker Innkjøringsfase (prosedyrekalibrering og internrevisjon): 1 måned Aktiv inkludering: 6 måneder Interim DSMB-analyse: måned 6 Klinisk oppfølging (pågående svangerskap og levendefødsel): 6 måneder post-inkludering Endelig statistisk analyse: 1 måned Manusforberedelse og innsending: 1 måned Total estimert varighet: ~20 måneder