Defragmentacja zarodka w 4. dniu: wskaźnik blastocysty i wyniki kliniczne (DEBRIS)

TŁO I UZASADNIENIE NAUKOWE Fragmentacja zarodków jest jedną z najczęściej obserwowanych nieprawidłowości morfologicznych podczas hodowli in vitro w technikach wspomaganego rozrodu (ART).
Bezjądrowe fragmenty cytoplazmatyczne powstają w wyniku asymetrycznego podziału komórki lub procesów apoptozy i mogą zajmować zmienny odsetek objętości zarodka.
Ich obecność jest konsekwentnie wiązana z obniżonym potencjałem implantacji, niższymi wskaźnikami formowania blastocysty oraz gorszymi wynikami klinicznymi w cyklach IVF/ICSI.

Obecne systemy oceny zarodków, w tym Konsensus Stambulski oraz system punktacji Gardnera dla blastocyst, uwzględniają fragmentację jako kluczowy parametr morfologiczny.
Zarodki z fragmentacją ≥10% na etapach podziału są ogólnie uważane za mające obniżony, ale nie nieobecny, potencjał rozwojowy, a ich postępowanie – w szczególności, czy aktywne usunięcie fragmentów jest korzystne – pozostaje przedmiotem trwającej debaty.

Mechaniczna i laserowa defragmentacja zarodków na wczesnych etapach podziału (dzień 2-dzień 3) jest praktykowana w wybranych laboratoriach ART od kilku dekad.
Uzasadnienie polega na tym, że fizyczne usunięcie bezjądrowych fragmentów może uwolnić blastomery od ograniczeń rozwojowych, zmniejszyć sygnalizację cytotoksyczną lub apoptotyczną oraz poprawić kompakcję i formowanie blastocysty.
Jednak opublikowane dowody dotyczące wczesnej defragmentacji są niejednorodne: niektóre badania donoszą o poprawie rozwoju blastocysty i wskaźników ciąży, podczas gdy inne nie wykazują istotnej korzyści, a nawet potencjalnej szkody spowodowanej stresem mechanicznym podczas manipulacji.

Istotna luka w literaturze dotyczy defragmentacji przeprowadzonej w dniu 4 (D4) hodowli, odpowiadającej etapowi moruli i wczesnej kompakcji.
Do D4 zarodki, które utrzymały kompetencję rozwojową, przechodzą kompakcję – kluczowe wydarzenie morfogenetyczne obejmujące polaryzację komórek, tworzenie ścisłych połączeń oraz ustanowienie linii wewnętrznej masy komórkowej i trofektodermy.
Biologiczne uzasadnienie defragmentacji D4 różni się od wcześniejszych interwencji: na tym etapie relacja między fragmentami a kompaktującymi blastomerami może być wyraźniej zdefiniowana, a usunięcie fragmentów może rzadziej zakłócać trwający podział komórkowy, potencjalnie wspierając proces kompakcji.

Wstępne dane obserwacyjne z naszego ośrodka sugerują, że defragmentacja D4 może być związana z wyższymi wskaźnikami użytecznych blastocyst w porównaniu z historycznymi grupami kontrolnymi, szczególnie w zarodkach z umiarkowaną fragmentacją (10-50%).
Te wstępne ustalenia, choć zachęcające, pochodzą z nierandomizowanych danych i mogą podlegać błędom selekcji.
Dlatego prospektywne, randomizowane, kontrolowane badanie kliniczne (RCT) jest niezbędne, aby określić, czy defragmentacja D4 rzeczywiście poprawia wyniki rozwojowe i kliniczne.

PROJEKT BADANIA Jest to prospektywne, randomizowane, kontrolowane, pojedynczo zaślepione badanie (badanie DEBRIS-D4 / DEFRAG-D4).
Badanie jest zaprojektowane zgodnie z wytycznymi CONSORT dotyczącymi raportowania badań randomizowanych i stosuje się do listy kontrolnej SPIRIT dla protokołów badań klinicznych.

Projekt pojedynczo zaślepiony: Embriolog oceniający jakość blastocyst w D5/D6 oraz sonografista oceniający ciążę kliniczną będą zaślepieni co do przydziału do grupy leczenia.
Zaślepienie embriologa wykonującego procedurę D4 nie jest możliwe ze względu na charakter interwencji.

Jednostka randomizacji: Randomizacja odbywa się na poziomie pacjentki (a nie zarodka), aby uniknąć zanieczyszczenia między grupami i odzwierciedlić kliniczną rzeczywistość zarządzania kohortą zarodków.

Czynniki stratyfikacji:

Wiek pacjentki: <35 lat vs. ≥35 lat
Liczba zarodków z fragmentacją ≥10% w D4: 1-2 vs. ≥3
Stosowanie przedimplantacyjnych testów genetycznych w kierunku aneuploidii (PGT-A): tak vs. nie

Metoda randomizacji: Wstępnie wygenerowane listy randomizacyjne z blokami o zmiennej wielkości (4 i 6), zarządzane za pomocą ponumerowanych, zaklejonych, nieprzezroczystych kopert.
Koperty są otwierane rano w dniu 4, po potwierdzeniu przez ocenę morfologiczną obecności co najmniej jednego zarodka spełniającego kryteria włączenia.

POPULACJA BADANA

Kryteria włączenia:

Pacjentki poddawane cyklom IVF/ICSI w ośrodku uczestniczącym
Wiek 18-43 lata
FSH podstawowe < 20 mIU/mL
Obecność ≥1 zarodka z fragmentacją cytoplazmatyczną ≥10% w ocenie morfologicznej D4
Zarodki przeznaczone do przedłużonej hodowli do etapu blastocysty (D5/D6)
Pisemna świadoma zgoda uzyskana przed jakąkolwiek procedurą związaną z badaniem

Kryteria wyłączenia:

Cykle z komórkami dawcy (donacja oocytów lub nasienia)
Cykle z przedimplantacyjnymi testami genetycznymi w kierunku choroby monogenowej (PGT-M) jako głównym wskazaniem
Zarodki z rozlaną fragmentacją >50% lub ciężkim upośledzeniem morfologicznym w dniu 3
Równoczesny udział w innych interwencyjnych badaniach, które mogłyby zakłócić wyniki badania
Niezdolność do udzielenia świadomej zgody

INTERWENCJE

Grupa A - Defragmentacja D4 (Interwencja):

Defragmentacja mechaniczna lub laserowa zostanie przeprowadzona w dniu 4 (96 ± 2 godziny po zapłodnieniu), bezpośrednio po porannej ocenie morfologicznej.
Wszystkie zarodki należące do pacjentek zrandomizowanych do Grupy A z fragmentacją ≥10% zostaną poddane procedurze.

Procedura defragmentacji będzie przeprowadzana w standardowych warunkach mikromanipulacji:

Środowisko o niskiej ekspozycji na światło
Kontrolowana temperatura 37°C (podgrzewany stolik)
Maksymalny czas poza inkubatorem na pacjentkę: ≤10 minut
Technika: defragmentacja mechaniczna przy użyciu pipety biopsyjnej lub usunięcie laserowe (zgodnie z wewnętrzną procedurą operacyjną ośrodka)
Po defragmentacji zarodki zostaną zwrócone do hodowli w tych samych standardowych warunkach (inkubator time-lapse lub konwencjonalny, w zależności od przypadku)

Grupa B - Standardowa hodowla (Kontrola):

Zarodki w grupie kontrolnej nie będą poddawane żadnej dodatkowej manipulacji poza rutynową oceną morfologiczną w D4.
Aby zapewnić porównywalność warunków hodowli między grupami, ocena D4 u pacjentek kontrolnych będzie przeprowadzana przez tego samego operatora z takim samym czasem otwarcia inkubatora jak w grupie interwencyjnej (tzn. zarodki będą na krótko wyjmowane do oceny, ale natychmiast zwracane bez interwencji).

Standaryzacja laboratoryjna:

Dla obu ramion warunki hodowli będą identyczne przez całe badanie:

Pożywka hodowlana: ustandaryzowany produkt (do określenia w końcowym protokole)
Typ inkubatora: identyczny dla obu ramion (preferowany time-lapse)
Atmosfera gazowa: ustandaryzowany skład CO₂/O₂/N₂
Oceny morfologiczne w: dzień 1 (sprawdzenie zapłodnienia), dzień 3, dzień 4 (randomizacja), dzień 5, dzień 6
Punktacja blastocysty: system Gardnera (ekspansja, ocena ICM, ocena TE)

PUNKTY KOŃCOWE

Punkt końcowy pierwszorzędowy:

Wskaźnik użytecznych blastocyst (wynik Gardnera ≥3BB) na zarodek włączony do badania, oceniany w dniu 5 i dniu 6 hodowli in vitro (ramy czasowe: 6 dni od zapłodnienia).

Punkty końcowe drugorzędowe (z ramami czasowymi):

Ogólny wskaźnik rozwoju blastocysty (D5 + D6 łącznie) – ramy czasowe: dzień 6
Rozkład wyników Gardnera wśród uzyskanych blastocyst – ramy czasowe: dzień 6
Wskaźnik kriokonserwacji blastocyst – ramy czasowe: dzień 6-7
Wskaźnik implantacji (pęcherzyk ciążowy na przeniesioną blastocystę) – ramy czasowe: 5 tygodni po transferze
Wskaźnik ciąży klinicznej (wykryte bicie serca płodu w USG w 7 tygodniu) – ramy czasowe: 7 tygodni po transferze
Wskaźnik ciąży trwającej (żywa ciąża poza 12 tygodniem ciąży) – ramy czasowe: 12 tygodni po transferze
Wskaźnik żywych urodzeń na transfer zarodka – ramy czasowe: około 9 miesięcy po transferze
Analiza morfokinetyczna (jeśli inkubator time-lapse jest dostępny dla obu ramion) – ramy czasowe: dzień 6
Wskaźnik aneuploidii w zarodkach poddanych PGT-A (punkt końcowy eksploracyjny) – ramy czasowe: dzień 5-6 (biopsja) plus czas realizacji laboratorium

PLAN ANALIZY STATYSTYCZNEJ

Obliczenie liczebności próby:

Liczebność próby opiera się na punkcie końcowym pierwszorzędowym (wskaźnik użytecznych blastocyst ≥3BB na zarodek).
Zakładając wskaźnik blastocyst 42% w grupie kontrolnej i 57% w grupie interwencyjnej (bezwzględna różnica 15%), z mocą 80%, dwustronnym α = 0,05, przy użyciu testu chi-kwadrat z poprawką ciągłości Fleissa:

N na ramię ≈ 100-110 pacjentek
Z korektą 15% na wypadnięcie: N na ramię ≈ 115-130 pacjentek
Szacowana całkowita liczebność próby: N ≈ 230-260 pacjentek

Obliczenie liczebności próby zostanie zaktualizowane o ostateczne dane wstępne z ośrodka przed ostateczną rejestracją.
Konsultacja statystyczna z biostatystykiem zostanie uzyskana przed rozpoczęciem rekrutacji.

Analiza pierwszorzędowa:

Wskaźnik użytecznych blastocyst zostanie porównany między dwoma ramionami za pomocą testu chi-kwadrat (lub dokładnego testu Fishera dla małych prób).
Analiza pierwszorzędowa będzie zgodna z zasadą analizy w grupach zrandomizowanych (ITT), obejmując wszystkie zrandomizowane pacjentki niezależnie od odstępstw od protokołu.

Analizy drugorzędowe:

Wieloczynnikowa regresja logistyczna z korektą o wcześniej określone zmienne towarzyszące (wiek pacjentki, stopień fragmentacji, operator, typ inkubatora)
Wcześniej określone analizy podgrup: wiek <35 vs. ≥35 lat; stopień fragmentacji (10-25% vs. 26-50%); typ inkubatora (time-lapse vs. konwencjonalny)
Analiza zgodnie z protokołem (PP) jako analiza wrażliwości
Analiza przeżycia Kaplana-Meiera dla wyników ciąży trwającej i żywych urodzeń

Analiza pośrednia:

Planowana analiza pośrednia zostanie przeprowadzona przy 50% rekrutacji (około N=120 pacjentek), przejrzana przez niezależną Radę Monitorującą Bezpieczeństwo Danych (DSMB).
Zasady przerwania będą zgodne z granicą O’Briena-Fleminga dla skuteczności i wcześniej określonymi kryteriami bezpieczeństwa.

Brakujące dane:

Brakujące dane dla punktu końcowego pierwszorzędowego będą obsługiwane przy użyciu imputacji najgorszego scenariusza.
Dla danych o wynikach klinicznych zostanie zastosowana wielokrotna imputacja dla danych brakujących losowo.

ZBIERANIE I ZARZĄDZANIE DANYMI

Dane będą zbierane prospektywnie przy użyciu ustandaryzowanego Formularza Raportowania Przypadku (CRF).
Kluczowe domeny danych obejmują:

Dane wyjściowe pacjentki: wiek, BMI, FSH, AMH, liczba pęcherzyków antralnych (AFC), wskazanie do ART, liczba wcześniejszych cykli, protokół stymulacji, liczba pobranych i zapłodnionych oocytów.

Dane laboratoryjne D4: liczba ocenianych zarodków, liczba z fragmentacją ≥10%, stopień fragmentacji na zarodek (%), stadium morfodynamiczne w D4 (kompaktująca morula, pełna morula itp.), ramię randomizacji, technika defragmentacji (tylko Grupa A), czas trwania procedury, notatki operacyjne.

Dane laboratoryjne D5/D6: liczba blastocyst na dzień, wynik Gardnera na blastocystę (oceniany przez zaślepionego embriologa), liczba blastocyst poddanych kriokonserwacji.

Dane o wynikach klinicznych: przeprowadzony transfer zarodka (tak/nie), liczba przeniesionych blastocyst, ciąża biochemiczna (beta-hCG), ciąża kliniczna (bicie serca w 7 tygodniu), ciąża trwająca (12 tygodni), żywe urodzenie.

Wszystkie dane zostaną pseudonimizowane.
Zarządzanie danymi będzie zgodne z RODO (Rozporządzenie UE 679/2016) i obowiązującymi włoskimi przepisami o ochronie danych (D.Lgs. 196/2003).
Dane będą przechowywane w bezpiecznej, kontrolowanej dostępie bazie danych.

ETYKA I ZGODNOŚĆ REGULACYJNA Badanie uzyskało pozytywną opinię lokalnej Komisji Etycznej (Comitato Etico).
Wszystkie pacjentki otrzymają szczegółowy arkusz informacyjny dla pacjentki i udzielą pisemnej świadomej zgody przed jakąkolwiek procedurą związaną z badaniem.
Zgoda na badanie jest oddzielna od standardowej zgody na cykl IVF/ICSI.

Badanie zostanie zarejestrowane na ClinicalTrials.gov przed rekrutacją pierwszego uczestnika, zgodnie z wymaganiami ICMJE dotyczącymi rejestracji badań klinicznych.
Planowana jest również równoległa rejestracja w ISRCTN (Europa).

Badanie jest przeprowadzane zgodnie z Deklaracją Helsińską, wytycznymi ICH Dobrej Praktyki Klinicznej (GCP) oraz obowiązującymi włoskimi i europejskimi wymaganiami regulacyjnymi.

HARMONOGRAM BADANIA (SZACUNKOWY)

Sfinalizowanie protokołu i szkolenie zespołu: 1 miesiąc
Rejestracja na ClinicalTrials.gov i ISRCTN: 2 tygodnie
Faza wstępna (kalibracja procedur i audyt wewnętrzny): 1 miesiąc
Aktywna rekrutacja: 6 miesięcy
Pośrednia analiza DSMB: miesiąc 6
Obserwacja kliniczna (ciąża trwająca i żywe urodzenia): 6 miesięcy po rekrutacji
Ostateczna analiza statystyczna: 1 miesiąc
Przygotowanie i złożenie manuskryptu: 1 miesiąc
Szacowany całkowity czas trwania: ~20 miesięcy