难治性克罗恩病儿童和青年干细胞移植的初步研究。

克罗恩病 (CD) 是一种免疫介导的慢性疾病，具有复发和缓解过程，最常见于 20 岁或 30 岁，并导致终身健康和生活质量受损。 重症临床治疗的主要方法是联合使用抗炎药（如 5-氨基水杨酸盐​​）和免疫抑制药物（如皮质类固醇）和新型抗 TNF 抗体（如英夫利昔单抗）。 目前，这些药物都不能治愈，并且相关的部分患者对这些药理学方法中的许多方法都难以治疗。

已经在这组难治性患者中尝试了免疫清除治疗，然后进行自体干细胞拯救（自体 HSCT），并取得了成功的结果。 由于制备方案中使用的药物具有直接免疫清除作用，自体 HSCT 通过根除效应/记忆 T 细胞克隆在这种自身免疫环境中有效；通过导致免疫重置-从输注的干细胞中恢复 T 细胞克隆不会产生自身免疫反应并且对“自身”抗原具有耐受性，并且通过上调 T 调节细胞（Treg、CD4+CD25+ FOXP3+ 或 CD8+ FOXP3+) 通过移植过程中细胞因子环境的变化。 Tregs 数量的增加限制了自身反应性效应 T 细胞的活性。

这项初步研究旨在获得先前发表的难治性 CD 成人自体 HSCT 研究的成功，目的是确认 HSCT 和移植后环磷酰胺在儿科患者和年轻人接受 HSCT 后的可行性、安全性和有效性成年人。

由于尚未在患有 CD 的儿童中广泛研究这种免疫清除疗法与移植后环磷酰胺的组合，因此移植相关死亡率 (TRM) 和严重毒性（> NCI 标准的 3 级毒性）将在术后 100 天进行监测-在过度毒性或 TRM (>10%) 的情况下，将强制执行所有患者的移植和停止规则。 临床评估将在 HSCT 后 1 年内针对疾病活动、无类固醇缓解期进行，以评估该程序的“临床疗效”。

该试验的主要目的是生成初步安全数据，以确认自体 HSCT 对患有难治性 CD 的儿童和年轻人的可行性和益处。

学习规划：

这是一项单臂试验性研究，旨在评估使用自体干细胞进行造血干细胞移植 (HSCT) 免疫消融的可行性、安全性和益处，然后对患有难治性克罗恩病 (CD) 的儿童和年轻人进行移植后环磷酰胺治疗). 研究人群是年龄≥10 岁且≤30 岁的严重难治性克罗恩病患者。

目标：

主要目标：

确定 HSCT 免疫消融和 HSCT 后输注环磷酰胺对患有难治性克罗恩病 (CD) 的儿童和年轻人的可行性和毒性。 将监测 HSCT 后前 100 天内的死亡（移植相关死亡率，TRM）和严重的非血液学毒性（≥ 3 级毒性；NCI 毒性标准 4.0 版）以满足该终点。

次要目标：

次要目标是评估 HSCT 相关并发症的发生率和反应评估。 这些包括：

1. 病毒再激活的发生率 - CMV 和 EBV
2. 侵袭性真菌感染的发生率
3. HSCT 淋巴细胞亚群（CD3、CD4、CD8 和 CD19 细胞的绝对数量）、免疫球蛋白水平（IgG）和 CD4+ CD25+ CD127+ 调节性 T 细胞（Treg）群体在第 +30 天、+60 天、+100 天、+180 天后的免疫重建和每年 HSCT 后。
4. 在 HSCT 后 1 年，通过对 CD 临床活动的系列评估、疾病严重程度评估-CDAI 评分和无类固醇缓解期的长度，评估 HSCT 在该人群中的疗效和益处。

假设：

主要：HSCT 和移植后环磷酰胺方案将具有良好的耐受性和可接受的毒性，并将导致 <10% 的移植相关死亡率 (TRM)。

背景和理由：

克罗恩病 (CD) 是一种免疫介导的慢性疾病，病因不明，但可能是由于接触肠道细菌或其成分抗原导致过多的 1 型 T 辅助细胞 (TH-1) 介导的胃肠道慢性炎症所致(GI) 道 1. 克罗恩病是一种复发和缓解型疾病，最常见于 20 岁或 30 岁，会导致终身健康和生活质量受损 2。

无论使用何种疗法，一些患者在用尽多种治疗选择后仍然患有活动性疾病的重病。 此外，难治性疾病患者会出现无法进食、经常出现恶心、呕吐、腹泻、营养不良、生长迟缓、瘘管形成、腹痛和心理困扰、回肠造口术或结肠造口术以及可能导致短肠综合征的多次手术，严重影响生活质量。 虽然没有很好地表征，但在这组患者中存在明显的过高死亡率 3,4。

与正常人群相比，难治性 CD 患者的死亡率更高（风险比为 1.73）；但长期幸存者的死亡通常与手术并发症、肝病、感染和肠癌有关 5。 尽管这组患者的总体死亡率很低，但他们的发病率、皮质类固醇副作用和生活质量都很差，而且 50% 的难治性疾病患者将需要手术干预（回肠造口术、结肠造口术），进一步影响并发症发生率2,3。

许多药物已被用于控制 CD 的症状，但目前没有一种药物可以治愈，并且相关的部分患者对许多药理学方法都难以治疗 6。几乎所有用于疾病晚期形式的药物，例如免疫抑制剂和免疫调节剂，具有潜在风险。 临床治疗的主要方法是联合使用抗炎药（如 5-氨基水杨酸盐​​）和免疫抑制药物（如皮质类固醇）4。 大多数患有严重难治性疾病的患者接受抗肿瘤坏死因子 (TNF) 抗体治疗，如英夫利昔单抗 (Remicade)，但对于抗 TNF 治疗无效的患者，选择有限 7。 大约 40% 的 CD 患者会出现无法忍受的副作用或对抗 TNF 治疗没有反应，因此这一亚组患者的选择非常有限 8。

一些症状可以通过长期使用类固醇来控制，但有许多已知的持续使用类固醇的长期影响 - 肌肉损失、骨质减少、白内障和库欣样习惯。 这些患者中的大多数参加了其他实验性 I/II 期药物试验或诉诸手术干预来控制症状。 手术方法（通过回肠结肠造口术切除发炎部分的部分肠道）是一种选择，但与感染风险、心理社会和美容问题以及短肠综合征导致的发病率增加有关，尤其是在年轻人中。 死亡率增加也与手术干预有关 2,3。

因此，任何避免对年轻人进行手术或长期使用皮质类固醇的干预措施都可能是有益的。 鉴于造血干细胞移植 (HSCT) 在其他以免疫耐受丧失和/或 TH-1 为主的免疫反应为特征的自身免疫性疾病中具有一定的价值，这些程序可能在 CD 9 中具有价值， 10. 自体移植也可能是有益的，因为清除体内的定型淋巴细胞克隆可能会使患者恢复到易患 CD 但未患 CD 的原状 11。

CD 的 HSCT 的基本原理

HSCT 可通过以下方式为自身免疫性疾病带来益处：

1. 由于制备方案中使用的药物的直接免疫消融作用，效应/记忆 T 细胞克隆的根除。
2. 免疫重置：从注入的干细胞中恢复的 T 细胞克隆不会产生自身免疫反应，并且对“自身”抗原具有耐受性。
3. T 调节细胞（Treg、CD4+CD25+FOXP3+ 或 CD8+ FOXP3+）的上调 - 通过移植期间细胞因子环境的变化。 Tregs 数量的增加限制了自身反应性效应 T 细胞的活性。
4. 未定型的干细胞在肠粘膜中的植入可能导致粘膜的直接愈合。

HSCT 在克罗恩病中有效性的证据 初步观察是在患有克罗恩病和血液系统恶性肿瘤的患者中进行的。 对于因血液系统恶性肿瘤而接受 HSCT 的患者，他们的克罗恩病得到了缓解 12。

几项研究报告了克罗恩病患者因另一种情况接受自体移植的临床过程。 也许最有趣的是一名患者，他在 9 岁时出现症状，4 年后被诊断出患有克罗恩病，并且在接下来的 7 年里需要大量治疗 13。 据报道，在非霍奇金淋巴瘤自体干细胞移植后，在接下来的 7 年内没有临床或实验室证据表明他的克罗恩病复发。 另一例报告的克罗恩病病例在移植前患有弥漫性全结肠炎，3 年后在内镜检查时无症状（但有炎症）14。 另一名患有有症状克罗恩病 2 年并接受手术的患者在移植后 5 年没有疾病。 系统的结肠镜评估显示持续的亚临床炎症最初逐渐清除。 在范德比尔特，我们为患有 AML 和克罗恩病的患者进行了无关的供体移植。 他目前在移植后 10 年没有克罗恩病的症状。

专门针对克罗恩病的 HSCT：

克罗恩病干细胞移植的第一份报告涉及来自芝加哥组 15 的 2 名患者。 尽管用英夫利昔单抗治疗，但在两个初始病例中，克罗恩病活动指数均超过 250（正常范围 <150，病理范围 220 - 600）。 在这两名患者中，使用环磷酰胺和粒细胞集落刺激因子 (G-CSF) 动员外周血干细胞 (PBSC)，通过 CD 34+ 选择离体富集。 移植前使用环磷酰胺和抗胸腺细胞球蛋白 (ATG) 进行免疫调节。 第一位患者是一位 22 岁的女性，她有右半结肠切除术的既往病史，患有严重的回结肠克罗恩病，导致顽固性腹泻，每天排便 25 次，并伴有瘘管和肛周败血症。 第二个是一名 16 岁的男孩，他已经身体不适 6 年，需要管饲并接受甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤和 5 氨基无环酸治疗，患有克罗恩结肠炎。 在这两种情况下，移植后腹泻都得到解决，克罗恩病活动指数也恢复正常。 第一位患者的血红蛋白升高，而第二位患者的血红蛋白水平保持在略低于正常水平。 移植后 CRP 在正常范围内，白蛋白保持或变得正常。 这些病例伴有广泛的疾病活动性结肠镜检查证据。 在移植之前，这两个病例都有严重活动性克罗恩病区域，伴有鹅卵石石化、裂隙和深部溃疡。 移植后肠道仍然不正常，尽管变化非常小，只有表面糜烂。

Oyama 等人报告了 12 名中位年龄为 27 (15-38) 且患有严重难治性克罗恩病 16 的患者的自体 HSCT。 预处理方案由环磷酰胺 (200 mg/kg) 和马 ATG (90 mg/kg) 组成。 12 名患者中有 11 名进入了由 CDAI < 150 定义的持续缓解。 在中位随访 18.5 个月（范围 7-37 个月）后，只有一名患者在 HSCT 后 15 个月发生活动性 CD 复发。

Hasselbatt 等人报告了 12 名难治性克罗恩病患者（年龄 24-50 岁）使用高剂量环磷酰胺（200 mg/kg）无 ATG 17 进行自体 HSCT。动员化疗后 PBSC 收获在 11/12 名患者中成功并导致临床和 7/12 名患者的内窥镜改善。 随后对 9 名患者进行了预处理和 autoPBSCT，并且耐受性相对较好。 其中，5 名患者在 autoPBSCT 后 6 个月内获得临床和内镜缓解。 然而，7/9 的患者在随访期间出现复发，但可以通过低剂量皮质类固醇和常规免疫抑制治疗来控制疾病活动。

2010 年，Burt 等人报告了 24 名平均年龄为 24 岁（范围 15-52 岁）且患有抗 TNF 难治性克罗恩病的患者的自体 HSCT 18。使用环磷酰胺 (2.0 g/m2) 和G-CSF（10 微克/千克/天），通过 CD34 选择离体富集，并在用环磷酰胺（200 毫克/千克）和马抗胸腺细胞球蛋白（ATG，90 毫克/千克）或兔 ATG 进行免疫抑制调节后重新输注（ 6 毫克/千克）。 24 名患者中有 18 名在移植后 5 年或更长时间。 所有患者均进入缓解期，CDAI 小于 150。 临床无复发生存率定义为移植后无需重新开始 CD 药物治疗的百分比，1 年时为 91%，2 年时为 63%，3 年时为 57%，4 年时为 39%，5 年时为 19%年。

在移植后超过 5 年的任何移植后评估间隔中，缓解（CDAI < 150）、无类固醇或无药物治疗的患者百分比分别保持在或大于 70%、80% 和 6%。

调节性 T 细胞 (Tregs) 和自身免疫性疾病：

调节性 T 细胞 (Treg) 与抑制免疫反应和维持耐受性有关 19,20。 CD4+CD25+FOXP3+ T 细胞（T regs）的百分比在 SLE 和 1 型糖尿病等自身免疫性疾病患者中显着降低 20。 此外，Treg 的转移可以防止动物模型中 Treg 耗尽后产生的自身免疫表型。

在针对自身免疫性疾病的 HSCT 期间，Treg 细胞群的增加与缓解诱导相关。 Zhang 等人表明，HSCT 会导致新生成的 Treg 细胞群，使患者保持真正的免疫缓解 21。

Burt 等人还评估了 Treg 细胞在他们的一些接受 HSCT 治疗 CD 的患者中的作用。 在 HSCT 之前，与正常志愿者 (3.86% ± 1.67%) 相比，CD 患者的 Treg 细胞平均百分比 (2.62% ± 2.01%) 显着较低。 在 HSCT 后观察到 Treg 百分比的强劲增加，但这不会持续一段时间，并且可能导致复发 18。 因此，有临床证据表明，Treg 群体的持续增加可能会维持自身免疫性疾病患者的缓解。

拟议研究的理由：

该初步研究旨在评估对英夫利昔单抗/和/或其他免疫抑制剂无反应的难治性疾病患者进行 HSCT 的可行性和 HSCT 后环磷酰胺输注的安全性。 这是一项小型试点研究，在过度毒性或死亡的情况下内置了“停止规则”。

免疫清除方案的基本原理：

CY 动员的基本原理：环磷酰胺 (CY) 将用于外周干细胞的动员和 HSCT 之前的免疫消融。 CY 传统上用于所有 HSCT 的动员，以治疗难治性 CD。

移植后环磷酰胺 (CY) 的基本原理——最近，约翰·霍普金斯 (John Hopkins) 率先使用移植后 CY，并证明它对接受 HSCT 治疗血液系统恶性肿瘤的患者是一种非常有效的 GVHD 预防，即使是在 HLA 不匹配和半相合的情况下捐助者。 CY 的移植后递送允许有效删除引起 GVHD 的增殖同种异体反应性 T 细胞，而不会增加方案的毒性 22。 在霍普金斯大学小组最近的一项研究中，移植后环磷酰胺成功地用于接受单倍相合骨髓移植的镰状细胞病患者，且无毒性。

一些研究已经进行了 CD34+ 干细胞选择，以去除所有免疫反应性 T 细胞克隆，并使用纯化的 CD34+ 输注来再生免疫系统 18。 这种方法的问题是移植后免疫重建延迟和感染发生率较高。

欧洲试验已使用未经处理的外周血干细胞 (PBSC) 作为输注（没有任何 T 细胞耗竭或 CD34+ 选择）用于自身免疫性疾病的 SCT 23。 由于外周干细胞含有相同的 T 细胞克隆，这些克隆具有免疫反应性，并且在非 T 细胞耗尽输注中与供体干细胞一起输注，这可能是迄今为止完成的 T 细胞充足 HSCT 复发的原因之一用于 CD。

因此，为了克服上述问题，我们建议使用未经处理的 PBSC，但在干细胞输注前和干细胞输注后给予两剂 CY，以有效耗尽自体输注中存在的免疫反应性 T 细胞克隆因此，减少复发的发生率。 CY 的总剂量保持不变 (200 mg/kg)，因此，它不会增加方案的毒性，但可能导致更有效地耗尽免疫反应性克隆，从而避免昂贵的体外实验T 细胞耗竭/CD34+ 选择。

此外，CY 会导致所有 T 细胞亚群的持续耗竭，但会导致 CD4+ CD25- 亚群的更深层次耗竭，导致 CD4+CD25+ 细胞相对富集，我们希望通过使用移植后环磷酰胺对其进行扩展。

Rabbit-ATG（Thymoglobulin，Genzyme Corp，Cambridge，MA）的基本原理：也将用于有效的免疫消融和干细胞输注后的体内 T 细胞耗竭。 将使用兔 ATG，因为这已被证明可以促进体外功能性 Tregs 的扩展 24。 Burt 等人 18 在最大的研究中使用了兔子 ATG。

（请注意参考编号可在协议第 25-26 页找到。）