通过拉曼光谱在 ALS (SalivALS) 中发现唾液生物标志物 (SalivALS)

样本收集：所有选定受试者的唾液收集将按照 Salivette (SARSTEDT) 制造商的说明进行。 为了限制与 ALS 无关的唾液含量的可变性，将在固定时间从所有受试者获得唾液，在喂食和刷牙的适当滞后时间之后。 预分析参数（即 存储温度和收集和处理之间的时间），饮食和吸烟习惯将被适当记录。 简而言之，取出拭子，放入口中并咀嚼 60 秒以刺激唾液分泌。 然后将拭子以 1,000 g 离心 2 分钟，以去除细胞碎片和食物残渣。 收集的样品将储存在-80°C。

样品处理：在拉曼采集之前，唾液样品将使用不同的截止范围（3、10 和 30 kDa）进行过滤，通过 RS 收集和分析洗脱的样品并丢弃浓缩的对应物。 对于拉曼分析，将每个样品的一滴滴在铝箔上，以实现表面增强拉曼散射 (SERS)。

数据收集：使用 Aramis 拉曼显微镜（Horiba Jobin-Yvon，法国）获取拉曼和 SERS 光谱，该显微镜配备了在 785 nm 下工作的激光光源，激光功率范围为 25-100%（最大功率 512 mW）。 将使用 10-30 秒之间的采集时间。 仪器将在每次分析前使用 520.7 cm-1 处的硅参考带进行校准。 拉曼光谱将从沿着从液滴边缘到中心的线图的 15 个点收集。 使用 50 倍物镜（奥林巴斯，日本）在 400 和 1800 cm-1 之间的区域获取光谱。 光谱分辨率约为 1.2 cm-1。 LabSpec 6 软件包（Horiba Jobin-Yvon，法国）将用于地图设计和光谱采集。

数据处理：所有获取的光谱将使用五次多项式基线进行拟合，并使用专用软件 LabSpec 6 通过单位向量进行归一化。 底物的贡献将从每个光谱中去除。 验证该方法的统计分析将使用多变量分析方法进行。 将执行主成分分析 (PCA) 以减少数据维度并证明主要趋势。 前 20 个生成的主成分 (PC) 将用于分类模型、线性判别分析 (LDA)，以区分数据以最大化所选组之间的方差。 将选择最少数量的 PC 以防止数据过拟合。 留一法交叉验证和混淆矩阵检验将用于评估LDA模型的方法灵敏度、精密度和准确度。 Mann-Whitney 将在 PC 分数上执行，以验证分析组之间统计相关的差异。 相关性和偏相关性分析将使用 Spearman 检验进行，假设只有 p 值低于 0.05 的系数是有效的相关性。 统计分析将使用 Origin2018 (OriginLab, USA) 进行。