阴道微生物组和代谢组与多胎妊娠中的自然早产 (sPTB) 相关吗？ (SPRUCE)

当前研究的理由

缺乏证据表明任何预防多胎妊娠中发生 sPTB 的方法都有益处，这意味着迫切需要新的方法来解决这一重大的健康不平等问题。 尽管越来越多的证据表明阴道微生物组和阴道粘膜代谢组及其与 sPTB 的关联，但尚无研究在多胎妊娠中分析这些因素；既没有确定与单胎妊娠的任何差异，也没有探索与 SPTB 的任何独特关联。 发现新的关联将有助于我们可靠地预测 sPTB 风险最高的女性，并确定那些最有可能从筛查和干预中受益的女性。

这项研究的总体目的是评估多胎妊娠的阴道微生物组，以确定其是否与单胎妊娠不同，并将结果与​​我们庞大且独特的低风险和高风险单胎队列（哈里斯福祉早产中心）进行比较。 此外，还将与国际公认的合作者合作，利用新型 DESI MS 分析来评估多胎妊娠的阴道粘膜代谢特征。 这项研究将是第一个评估多胎妊娠中阴道微生物组和阴道粘膜代谢特征的研究，并评估表型良好的多胎妊娠人群中阴道微生物组、代谢组和 sPTB 之间的关联。 此外，这项研究将通过收集血液样本和宫颈硬度测量来利用独特的多胎妊娠队列进行未来的探索性分析，最终旨在为多胎妊娠开发成功的风险分层模型。

研究问题/目标

与低风险和高风险单胎妊娠相比，评估多胎妊娠的阴道微生物组，并评估阴道微生物组、阴道代谢组和 sPTB 之间的关联。

目标

SPRUCE 研究有以下总体目标：

• 比较多胎妊娠和单胎妊娠的阴道微生物组
• 评估多胎妊娠中阴道微生物组与 sPTB 的关联
• 评估多胎妊娠中阴道代谢组与 sPTB 的关联

研究设计和数据收集方法

对 120 名多胎妊娠妇女进行的单中心前瞻性队列研究。 高位阴道拭子、血液采样和 CL 测量将在妊娠 16 周和 28 周时进行。 还将在妊娠 16 周时（拭子采集期间）测量宫颈硬度。 然后，将在胎膜完整的女性临产/引产/剖腹产 (C/S) 之前收集阴道拭子（见图 1）。 所有女性 (n = 120) 的阴道样本将通过 16S rRNA 基因测序和定量、代谢组学分析、念珠菌定量 PCR 和 FFN 进行表征，PTB 病例 (约 23 例) 和匹配对照的样本将另外进行宏基因组分析。 血液样本将被存储，用于未来的探索性生物标志物和与早产预测相关的蛋白质组学分析，并将记录宫颈硬度测量值，以供未来研究其与早产的潜在关联。

学习规划

参与者将直接从 LWH 的多胎妊娠诊所 (MPC) 招募。 所有怀双胞胎的女性在预约产前护理时都会收到一份患者信息传单，并且研究团队的一名成员将邀请他们在怀孕 16 周时首次访问 MPC。 此时，他们将收到有关该研究的进一步口头信息，并有机会提问。 如果女性同意参与，她们将签署研究特定的知情同意书，并在定制的电子数据采集系统上注册，该系统将生成唯一的参与者识别号。 只要女性愿意决定是否参与这项研究，她们就可以被允许。 如果女性需要更多时间来决定是否参加研究，我们将提供进一步的预约。 只有在参与者同意后才会安排样本采集。

在知情同意后，将要求妇女填写一份健康调查问卷，提供有关孕产妇医疗和手术史、基本人口统计和社会经济背景的信息。 然后，他们将被要求提供高阴道拭子样本和宫颈硬度测量值（通过窥器检查）、血液样本和 CL 测量值（通过经阴道超声）。 这些评估将在妊娠 16 周时进行。 将在妊娠 28 周时重复进行阴道拭子、血液样本和 CL 测量，并将在胎膜完整的女性临产/引产/剖腹产 (CS) 之前收集更多阴道拭子。 在每次采集血液和窥器检查之前，患者将填写一份简短的调查问卷，说明是否有任何当前的药物治疗、最近的抗生素和/或抗真菌治疗或性交。 如果患者在过去 48 小时内进行过阴道性交，样本采集将推迟至稍后的预约。

如果有证据表明第 16 周时 CL 缩短（<25 毫米），患者将按照当地利物浦妇女医院 (LWH) 的政策接受治疗。 参与者不会被排除在研究之外，计划中的评估仍将进行。

对于高位阴道拭子，患者将接受窥器检查，并在后穹窿直视下采集拭子。 如果在分娩时采集拭子，则将在阴道指检之前进行。 宫颈硬度测量将与阴道拭子同时进行。

一旦招募，参与者将继续参与研究直至分娩（双胎妊娠通常不晚于 38 周）并出院。 将从所有参与者的笔记和电子医院记录中收集孕产妇和新生儿结局的常规临床数据。 所有研究访问都将与常规护理同时进行，所有参与的女性将在整个怀孕期间根据 NICE 双胞胎和三胞胎妊娠指南接受常规产前护理。

样品尺寸

LWH 的多胎妊娠诊所每年进行 100 次 CL 扫描。 由于 CL 扫描的可接受性，预计招募率为 80%。 因此，保守估计，在 18 个月期间，参与者预计将达到 120 人。

根据 <34 周的早产率估计为 19%（LWH 数据），则估计的精确度由标准误差或 3.6% 给出，这意味着早期分娩率应使用 95% 的置信区间来估计，该区间定义为+-7% 的精确度。 此外，这将导致观察队列中大约有 23 例早产，这将允许进行包括 2 个协变量在内的多变量分析，以确定感兴趣的临床/人口因素与早期分娩率之间的关联强度。

结果衡量标准

主要结局是妊娠 34 周以下的 sPTB。 基于 16S rRNA 基因测序的阴道微生物群预测将包括阴道细菌总量；阴道微生物群组成类型；卷曲乳杆菌、惰性乳杆菌、所有乳酸杆菌、所有 BV 厌氧菌以及所有致病菌的阴道相对丰度和估计浓度。 在所有女性中测量的其他预测因子将包括阴道念珠菌酵母浓度、FFN 浓度和使用 20-30 个代谢组预测因子的代谢组数据，这些预测因子基于伦敦帝国理工学院 David MacIntyre 等人之前对单胎妊娠的研究结果。 在巢式病例对照研究中，将使用已建立的生物信息学流程从宏基因组数据中提取额外的预测因子。

将记录次要孕产妇和新生儿结局以进行描述性分析：

• 产妇结局：未足月胎膜早破、产妇感染（疑似绒毛膜羊膜炎需要静脉注射抗生素治疗）、分娩妊娠（<28 周/<32 周）、分娩方式、PTB 治疗。
• 新生儿结局：妊娠并发症 (TTTS/SFGR/TAPS)、活产、胎儿/新生儿死亡、出生体重、新生儿发病率 (IVH/NEC/ROP)、入住 NICU、呼吸机依赖和 NICU 出院年龄。

统计方法

完整的 16S 微生物群数据（所有样本中的所有细菌分类群）将首先在所有女性以及患有和不患有 sPTB 的女性的热图中可视化。 然后，通过计算每个单独样本的以下内容，汇总数据以用于生物统计学病因学模型：卷曲乳杆菌、惰性乳杆菌、所有乳酸杆菌组合、所有 BV 厌氧菌组合、所有病原体组合、所有细菌组合的估计浓度（来自 16S 基因 qPCR）和所有念珠菌物种组合（也通过 qPCR）；阿尔法多样性（逆辛普森指数）；和微生物群组成类型的层次聚类。 这些微生物群变量将使用逻辑回归一次测试一个，并以出生结果作为因变量。 这些分析的结果还将与我们先前存在的高风险和低风险早产单胎队列中的类似分析结果进行比较 (1)。

将对宏基因组和代谢组数据集进行无监督和监督多变量分析。 使用主成分分析 (PCA) 的后续分析将用于一般聚类趋势的可视化，随机森林 (RF) 分类器将用于群体歧视分析。 还将对源自短链和长链脂肪酸以及生物胺的特定 DESI-MS 代谢物特征进行针对性分析，这些代谢物特征此前已被发现与阴道微生物组组成和免疫/炎症激活状态相关 (2)。