Il microbioma vaginale e il metaboloma sono associati alla nascita pretermine spontanea (sPTB) nelle gravidanze multiple? (SPRUCE)

MOTIVAZIONE PER LO STUDIO ATTUALE

La mancanza di prove a favore di qualsiasi modalità di prevenzione della sPTB nelle gravidanze multiple significa che sono urgentemente necessari nuovi approcci per affrontare questa grave disuguaglianza sanitaria. Nonostante le crescenti prove riguardanti sia il microbioma vaginale che il metaboloma della mucosa vaginale e la sua associazione con sPTB, nessuno studio li ha analizzati in gravidanze multiple; né determinare alcuna differenza rispetto alle gravidanze singole né esplorare eventuali associazioni uniche con sPTB. La scoperta di nuove associazioni aiuterà la nostra capacità di prevedere in modo affidabile le donne a più alto rischio di sPTB e di identificare quelle che hanno maggiori probabilità di trarre beneficio dallo screening e dall’intervento.

Lo scopo generale di questo studio è valutare il microbioma vaginale nelle gravidanze multiple per accertare se differisce dalle gravidanze singole, confrontando i risultati con la nostra ampia ed unica coorte di gravidanze singole a basso e ad alto rischio (Harris-Wellbeing Preterm Birth Centre). Inoltre, il profilo metabolico della mucosa vaginale sarà valutato in gravidanze multiple, lavorando con collaboratori riconosciuti a livello internazionale per utilizzare la nuova analisi DESI MS. Questo studio sarà il primo a valutare sia il microbioma vaginale che il profilo metabolico della mucosa vaginale in gravidanze multiple e a valutare le associazioni tra microbioma vaginale, metaboloma e sPTB in una popolazione di gravidanze multiple ben fenotipizzata. Inoltre, questo studio utilizzerà la coorte unica di gravidanze multiple raccogliendo campioni di sangue e misurazioni della rigidità cervicale per future analisi esplorative, con l'obiettivo finale di sviluppare un modello di stratificazione del rischio di successo per le gravidanze multiple.

DOMANDE/SCOPO(I) DI RICERCA

Valutare il microbioma vaginale in gravidanze multiple rispetto alle gravidanze singole a basso e ad alto rischio e valutare le associazioni tra microbioma vaginale, metaboloma vaginale e sPTB.

OBIETTIVI

Lo studio SPRUCE ha i seguenti obiettivi generali:

• Confrontare il microbioma vaginale di gravidanze multiple con quello di gravidanze singole
• Valutare l’associazione del microbioma vaginale con sPTB nelle gravidanze multiple
• Valutare l'associazione tra metaboloma vaginale e sPTB nelle gravidanze multiple

PROGETTO DELLO STUDIO E METODI DI RACCOLTA DATI

Uno studio prospettico di coorte in un unico sito su 120 donne con una gravidanza multipla. Verranno eseguiti tamponi vaginali alti, prelievo di sangue e misurazione del CL alla 16a e 28a settimana di gestazione. Verrà misurata anche la rigidità cervicale alla 16a settimana di gestazione (durante il prelievo del tampone). I tamponi vaginali verranno quindi raccolti all'inizio del travaglio/induzione/prima del taglio cesareo (C/S) nelle donne con membrane intatte (vedere Figura 1). I campioni vaginali di tutte le donne (n = 120) saranno caratterizzati mediante sequenziamento e quantificazione del gene 16S rRNA, profilazione metabolomica, PCR quantitativa per Candida e FFN, mentre i campioni provenienti da casi PTB (circa 23) e controlli abbinati verranno inoltre sottoposti a profilazione metagenomica. I campioni di sangue verranno conservati per futuri biomarcatori esplorativi e l'analisi proteomica relativa alla previsione della nascita pretermine e le misurazioni della rigidità cervicale verranno registrate per ricerche future riguardanti le sue potenziali associazioni con la nascita pretermine.

PROGETTAZIONE DI STUDIO

I partecipanti verranno reclutati direttamente dalla clinica per gravidanze multiple (MPC) presso LWH. Tutte le donne incinte di gemelli riceveranno un opuscolo informativo per il paziente al momento della prenotazione per le cure prenatali e saranno invitate a partecipare alla loro prima visita all'MPC alla 16a settimana di gestazione da un membro del gruppo di ricerca. A questo punto riceveranno ulteriori informazioni verbali sullo studio e l'opportunità di porre domande. Se la donna accetta di partecipare, firmerà il modulo di consenso informato specifico dello studio e sarà registrata su un sistema elettronico di acquisizione dati su misura che genererà un numero identificativo univoco del partecipante. Le donne saranno ammesse finché vorranno decidere se partecipare allo studio. Se una donna necessita di più tempo per decidere sulla partecipazione allo studio, verrà offerto un ulteriore appuntamento. Il prelievo dei campioni verrà organizzato solo previo consenso del partecipante.

Dopo il consenso informato, alle donne verrà chiesto di completare un questionario sanitario che fornisce informazioni sulla storia medica e chirurgica materna, sui dati demografici di base e sul contesto socioeconomico. Verrà quindi chiesto loro di fornire campioni di tampone vaginale elevati e misurazioni della rigidità cervicale (tramite esame con speculum), campioni di sangue e misurazioni del CL (tramite ecografia transvaginale). Queste valutazioni verranno effettuate alla 16a settimana di gestazione. I tamponi vaginali, i campioni di sangue e la misurazione del CL verranno ripetuti alla 28a settimana di gestazione e ulteriori tamponi vaginali verranno raccolti all'inizio del travaglio/induzione/prima del taglio cesareo (CS) nelle donne con membrane intatte. Prima di ogni prelievo di sangue e di esame dello speculum, i pazienti compileranno un breve questionario indicando se sono in corso farmaci, recenti trattamenti antibiotici e/o antifungini o rapporti sessuali. Se la paziente ha avuto rapporti sessuali vaginali nelle ultime 48 ore il prelievo del campione verrà rinviato ad un appuntamento successivo.

Se vi è evidenza di un CL accorciato (<25 mm) a 16 settimane, il paziente verrà trattato secondo la politica locale del Liverpool Women's Hospital (LWH). Il partecipante non verrebbe escluso dallo studio di ricerca e le valutazioni pianificate avrebbero comunque luogo.

Per i tamponi vaginali alti la paziente verrà sottoposta ad esame con speculum e verranno prelevati tamponi sotto visione diretta dal fornice posteriore. Se i tamponi vengono prelevati al momento del parto, verranno eseguiti prima dell'esame vaginale digitale. La misurazione della rigidità cervicale verrà effettuata contemporaneamente insieme ai tamponi vaginali.

Una volta reclutati, i partecipanti rimarranno nello studio fino al parto (di solito non oltre 38 settimane in qualsiasi gravidanza gemellare) e alla dimissione dall'ospedale. I dati clinici di routine verranno raccolti dalle note di tutti i partecipanti e dalle cartelle cliniche elettroniche per gli esiti materni e neonatali. Tutte le visite di studio coincideranno con le cure di routine e tutte le donne partecipanti riceveranno cure prenatali di routine secondo le linee guida NICE sulla gravidanza gemellare e tripla durante tutta la gravidanza.

MISURA DI PROVA

La Clinica per gravidanze multiple dell'LWH esegue 100 scansioni CL all'anno. Ci si aspetterebbe un tasso di reclutamento dell'80% a causa dell'accettabilità di una scansione CL. Su un periodo di 18 mesi ci si aspetterebbe quindi un prudente 120 partecipanti.

Sulla base del tasso stimato di parti prematuri <34 settimane del 19% (dati LWH), un livello di precisione stimato è dato da un errore standard o 3,6%, il che significa che il tasso di parto precoce dovrebbe essere stimato con un intervallo di confidenza del 95% definito da Grado di precisione +-7%. Inoltre, ciò dovrebbe portare a circa 23 parti prematuri all'interno della coorte osservativa, il che consentirà analisi multivariate, comprese 2 covariate, per stabilire la forza dell'associazione tra fattori clinici/demografici di interesse e tasso di parto precoce.

MISURE DI RISULTATO

L'outcome primario sarà sPTB <34 settimane di gestazione. I predittori del microbiota vaginale basati sul sequenziamento del gene 16S rRNA includeranno la carica batterica vaginale totale; tipo di composizione del microbiota vaginale; e abbondanza relativa vaginale e concentrazioni stimate di L. Crispatus, L. iners, tutti i lattobacilli combinati, tutti gli anaerobi BV combinati e tutti i patobioni combinati. Ulteriori predittori misurati in tutte le donne includeranno la concentrazione di lieviti di Candida vaginale, la concentrazione di FFN e dati metabolomici utilizzando 20-30 predittori metabolomici che sono di interesse sulla base dei risultati di studi precedenti su gravidanze singole di David MacIntyre et al, Imperial College di Londra. Nello studio caso-controllo nidificato, ulteriori predittori verranno distillati dai dati metagenomici utilizzando pipeline bioinformatiche consolidate.

Gli esiti materni e neonatali secondari saranno registrati per analisi descrittive:

• Esiti materni: PPROM, infezione materna (che richiede trattamento antibiotico IV per sospetta corioamnionite), gestazione al parto (<28 settimane/<32 settimane), modalità del parto, trattamento PTB.
• Esiti neonatali: complicazioni della gravidanza (TTTS/SFGR/TAPS), nati vivi, morte fetale/neonatale, peso alla nascita, morbilità neonatale (IVH/NEC/ROP), ricovero in terapia intensiva neonatale, dipendenza dal ventilatore ed età alla dimissione dalla terapia intensiva neonatale.

METODOLOGIA STATISTICA

I dati completi del microbiota 16S (tutti i taxa batterici in tutti i campioni) verranno prima visualizzati nelle mappe di calore per tutte le donne e per le donne con e senza sPTB. I dati verranno quindi riepilogati per l'utilizzo in modelli eziologici biostatistici calcolando quanto segue per ogni singolo campione: concentrazioni stimate di L. Crispatus, L. iners, tutti i lattobacilli combinati, tutti gli anaerobi BV combinati, tutti i patobioni combinati, tutti i batteri combinati ( dal gene 16S qPCR) e tutte le specie di Candida combinate (anche mediante qPCR); diversità alfa (indice Simpson inverso); e tipi di composizione del microbiota mediante clustering gerarchico. Queste variabili del microbiota saranno testate una alla volta utilizzando la regressione logistica con l'esito della nascita come variabile dipendente. I risultati di queste analisi verranno confrontati anche con i risultati di analisi simili nelle nostre coorti preesistenti pretermine singole ad alto e basso rischio (1).

Verranno eseguite analisi multivariate supervisionate e non supervisionate sui set di dati del metagenoma e del metaboloma. L'analisi successiva mediante l'analisi delle componenti principali (PCA) verrà utilizzata per la visualizzazione delle tendenze generali del clustering e un classificatore Random Forest (RF) verrà utilizzato per le analisi discriminatorie di gruppo. Verranno inoltre eseguite analisi mirate delle caratteristiche specifiche dei metaboliti DESI-MS derivati ​​da acidi grassi a catena corta e lunga e ammine biogene che in precedenza si sono rivelate correlate con la composizione del microbioma vaginale e con lo stato di attivazione immunitaria/infiammatoria(2).