Czy mikrobiom i metabolom pochwy są powiązane ze spontanicznym porodem przedwczesnym (sPTB) w ciążach mnogich? (SPRUCE)

UZASADNIENIE BIEŻĄCEGO BADANIA

Brak dowodów na korzyść jakiejkolwiek metody zapobiegania sPTB w ciążach mnogich oznacza, że ​​pilnie potrzebne są nowe podejścia, aby zaradzić tej poważnej nierówności zdrowotnej. Pomimo coraz większej liczby dowodów dotyczących zarówno mikrobiomu pochwy, jak i metabolomu błony śluzowej pochwy oraz ich związku z sPTB, w żadnym badaniu nie analizowano ich w przypadku ciąż mnogich; ani nie określało żadnej różnicy w porównaniu z ciążami pojedynczymi, ani nie badało żadnych wyjątkowych powiązań z sPTB. Odkrycie nowych powiązań pomoże nam w wiarygodnym przewidywaniu kobiet o najwyższym ryzyku sPTB i identyfikowaniu tych, które najprawdopodobniej odniosą korzyści z badań przesiewowych i interwencji.

Ogólnym celem tego badania jest ocena mikrobiomu pochwy w ciążach mnogich w celu ustalenia, czy różni się on od ciąż pojedynczych, porównując wyniki z naszą dużą i unikalną kohortą ciąż pojedynczych niskiego i wysokiego ryzyka (Centrum Porodów Przedwczesnych Harris-Wellbeing). Ponadto profil metaboliczny błony śluzowej pochwy zostanie oceniony w przypadku ciąż mnogich, we współpracy z międzynarodowymi współpracownikami w celu wykorzystania nowatorskiej analizy DESI MS. To badanie będzie pierwszym, które oceni zarówno mikrobiom pochwy, jak i profil metaboliczny błony śluzowej pochwy w ciążach mnogich oraz oceni powiązania między mikrobiomem pochwy, metabolomem i sPTB w populacji ciąż mnogich o dobrze fenotypowanym charakterze. Co więcej, w tym badaniu wykorzystana zostanie unikalna kohorta ciąż mnogich poprzez pobranie próbek krwi i pomiary sztywności szyjki macicy do przyszłej analizy eksploracyjnej, której ostatecznym celem będzie opracowanie skutecznego modelu stratyfikacji ryzyka dla ciąż mnogich.

PYTANIE BADAWCZE/CEL(Y)

Ocena mikrobiomu pochwy w ciążach mnogich w porównaniu z ciążami pojedynczymi niskiego i wysokiego ryzyka oraz ocena powiązań pomiędzy mikrobiomem pochwy, metabolomem pochwy i sPTB.

CELE

Badanie SPRUCE ma następujące cele ogólne:

• Porównanie mikrobiomu pochwy w przypadku ciąż mnogich i ciąż pojedynczych
• Ocena związku mikrobiomu pochwy z sPTB w ciążach mnogich
• Ocena związku metabolomu pochwy z sPTB w ciążach mnogich

PROJEKT BADANIA I METODY ZBIERANIA DANYCH

Prospektywne badanie kohortowe w jednym ośrodku z udziałem 120 kobiet w ciąży mnogiej. W 16. i 28. tygodniu ciąży zostaną pobrane wysokie wymazy z pochwy, pobranie krwi i pomiar CL. Sztywność szyjki macicy będzie również mierzona w 16 tygodniu ciąży (podczas pobierania wymazu). Wymazy z pochwy zostaną następnie pobrane na początku porodu/indukcji/przed cięciem cesarskim (C/S) u kobiet z nienaruszonymi błonami płodowymi (patrz ryc. 1). Próbki z pochwy od wszystkich kobiet (n=120) zostaną scharakteryzowane za pomocą sekwencjonowania i oznaczania ilościowego genu 16S rRNA, profilowania metabolomicznego, ilościowej reakcji PCR i FFN w kierunku Candida, a próbki od przypadków PTB (około 23) i dopasowanych kontroli zostaną dodatkowo poddane profilowaniu metagenomicznemu. Próbki krwi będą przechowywane do celów przyszłych eksploracyjnych badań biomarkerów i analiz proteomicznych związanych z przewidywaniem porodu przedwczesnego, a pomiary sztywności szyjki macicy zostaną zarejestrowane na potrzeby przyszłych badań dotyczących potencjalnego powiązania z porodem przedwczesnym.

PROJEKT BADANIA

Uczestniczki będą rekrutowane bezpośrednio z kliniki ciąży mnogiej (MPC) przy LWH. Wszystkie kobiety w ciąży z bliźniakami otrzymają ulotkę informacyjną dla pacjenta podczas rezerwacji opieki przedporodowej i zostaną zaproszone do udziału w badaniu podczas pierwszej wizyty w MPC w 16 tygodniu ciąży przez członka zespołu badawczego. W tym momencie otrzymają dalsze ustne informacje na temat badania i możliwość zadawania pytań. Jeśli kobieta zgodzi się na udział, podpisze formularz świadomej zgody na badanie i zostanie zarejestrowana w specjalnie zaprojektowanym elektronicznym systemie gromadzenia danych, który wygeneruje unikalny numer identyfikacyjny uczestnika. Kobiety będą mogły brać udział w badaniu, jeśli będą chciały podjąć decyzję o wzięciu udziału w badaniu. Jeśli kobieta potrzebuje więcej czasu na podjęcie decyzji o udziale w badaniu, zostanie zaoferowana kolejna wizyta. Pobranie próbek zostanie zorganizowane wyłącznie po wyrażeniu zgody przez uczestnika.

Po wyrażeniu świadomej zgody kobiety zostaną poproszone o wypełnienie kwestionariusza zdrowotnego zawierającego informacje na temat historii medycznej i chirurgicznej matki, podstawowych danych demograficznych i pochodzenia społeczno-ekonomicznego. Następnie zostaną poproszone o pobranie próbek wymazu z pochwy o dużej zawartości, pomiary sztywności szyjki macicy (badanie wziernikiem), próbki krwi i pomiary CL (za pomocą ultrasonografii przezpochwowej). Ocena ta zostanie przeprowadzona w 16 tygodniu ciąży. Wymazy z pochwy, próbki krwi i pomiar CL zostaną powtórzone w 28 tygodniu ciąży, a dalsze wymazy z pochwy zostaną pobrane na początku porodu/indukcji/przed cięciem cesarskim (CS) u kobiet z nienaruszonymi błonami płodowymi. Przed każdym pobraniem krwi i badaniem wziernika pacjent wypełnia krótką ankietę zawierającą informację o aktualnie przyjmowanych lekach, przebytym ostatnio leczeniu antybiotykowym i/lub przeciwgrzybiczym lub odbyciu stosunku płciowego. Jeżeli w ciągu ostatnich 48 godzin pacjentka odbyła stosunek pochwowy, pobranie próbki zostanie przełożone na późniejszą wizytę.

Jeżeli po 16 tygodniach zostaną stwierdzone skrócenie CL (<25 mm), pacjentka będzie leczona zgodnie z lokalnymi zasadami Szpitala Kobiet w Liverpoolu (LWH). Uczestnik nie zostałby wykluczony z badania, a zaplanowane oceny nadal miałyby miejsce.

W przypadku wysokiego wymazu z pochwy pacjentka zostanie poddana badaniu we wzierniku, a wymaz zostanie pobrany pod bezpośrednim wzrokiem z tylnego sklepienia. Jeżeli w momencie porodu pobierane są wymazy, zostaną one wykonane przed badaniem palpacyjnym pochwy. Pomiar sztywności szyjki macicy będzie wykonywany jednocześnie z wymazem z pochwy.

Po rekrutacji uczestniczki pozostaną w badaniu aż do porodu (zwykle nie później niż 38 tygodnia w przypadku każdej ciąży bliźniaczej) i wypisu ze szpitala. Rutynowe dane kliniczne będą zbierane z notatek wszystkich uczestników i elektronicznych rejestrów szpitalnych dotyczących wyników leczenia matek i noworodków. Wszystkie wizyty studyjne będą zbiegać się z rutynową opieką, a wszystkie uczestniczące kobiety będą przez cały okres ciąży objęte rutynową opieką przedporodową zgodnie z wytycznymi NICE dotyczącymi ciąży bliźniaczej i trojaczej.

WIELKOŚĆ PRÓBKI

W Klinice Ciąży Mnogiej przy LWH wykonuje się 100 badań CL rocznie. Ze względu na akceptowalność badania CL oczekiwany jest wskaźnik rekrutacji na poziomie 80%. Oczekuje się zatem konserwatywnej liczby 120 uczestników w okresie 18 miesięcy.

Na podstawie szacowanego wskaźnika porodów przedwczesnych < 34 tygodni wynoszącego 19% (dane LWH) szacowany poziom precyzji podawany jest za pomocą błędu standardowego lub 3,6%, co oznacza, że ​​odsetek przedwczesnych porodów należy szacować z 95% przedziałem ufności określonym przez +-7% stopnia precyzji. Co więcej, powinno to prowadzić do około 23 porodów przedwczesnych w kohorcie obserwacyjnej, co umożliwi analizę wielu zmiennych, w tym 2 zmiennych towarzyszących, w celu ustalenia siły związku między istotnymi czynnikami klinicznymi/demograficznymi a wskaźnikiem wczesnych porodów.

MIERNIKI REZULTATU

Pierwszorzędowym wynikiem będzie sPTB <34 tygodnia ciąży. Predyktory mikroflory pochwy oparte na sekwencjonowaniu genu 16S rRNA będą obejmować całkowite obciążenie bakteryjne pochwy; rodzaj składu mikroflory pochwy; oraz względną liczebność pochwy i szacowane stężenia L. chrupiące, L. iners, wszystkich pałeczek kwasu mlekowego łącznie, wszystkich beztlenowców BV łącznie i wszystkich patobiontów łącznie. Dodatkowe czynniki predykcyjne mierzone u wszystkich kobiet będą obejmować stężenie drożdżaków Candida w pochwie, stężenie FFN i dane metabolomiczne przy użyciu 20–30 czynników predykcyjnych metabolomicznych, które są interesujące w oparciu o wyniki poprzednich badań dotyczących ciąż pojedynczych przeprowadzonych przez Davida MacIntyre'a i wsp., Imperial College London. W zagnieżdżonym badaniu kliniczno-kontrolnym dodatkowe predyktory zostaną wydestylowane z danych metagenomicznych przy użyciu ustalonych potoków bioinformatycznych.

Wtórne wyniki dla matek i noworodków zostaną zarejestrowane do analiz opisowych:

• Wyniki dla matki: PPROM, zakażenie matki (wymagające dożylnego leczenia antybiotykami w przypadku podejrzenia zapalenia błon płodowych), ciąża w momencie porodu (<28 tygodni/<32 tygodni), sposób porodu, leczenie PTB.
• Wyniki u noworodków: powikłania ciąży (TTTS/SFGR/TAPS), poród żywy, śmierć płodu/noworodka, masa urodzeniowa, zachorowalność noworodków (IVH/NEC/ROP), przyjęcie na OITN, zależność od respiratora i wiek w chwili wypisu z OIOM-u.

METODOLOGIA STATYSTYCZNA

Pełne dane dotyczące mikrobioty 16S (wszystkie taksony bakteryjne we wszystkich próbkach) zostaną najpierw zwizualizowane na mapach cieplnych dla wszystkich kobiet oraz kobiet z sPTB i bez nich. Dane zostaną następnie podsumowane do wykorzystania w biostatystycznych modelach etiologicznych poprzez obliczenie dla każdej pojedynczej próbki następujących danych: Szacunkowe stężenia L. chrupiące, L. iners, wszystkich pałeczek kwasu mlekowego łącznie, wszystkich beztlenowców BV łącznie, wszystkich patobiontów łącznie, wszystkich bakterii łącznie ( z genu 16S qPCR) i wszystkie gatunki Candida łącznie (również metodą qPCR); różnorodność alfa (odwrotny indeks Simpsona); oraz typy składu mikroflory według hierarchicznego grupowania. Te zmienne dotyczące mikroflory będą testowane pojedynczo przy użyciu regresji logistycznej, w której zmienną zależną jest wynik porodu. Wyniki tych analiz zostaną również porównane z wynikami podobnych analiz przeprowadzonych w naszych wcześniej istniejących kohortach pojedynczych wcześniaków wysokiego i niskiego ryzyka (1).

Na zbiorach danych metagenomu i metabolomu zostaną przeprowadzone nienadzorowane i nadzorowane analizy wielowymiarowe. Późniejsza analiza z wykorzystaniem analizy głównych składowych (PCA) zostanie wykorzystana do wizualizacji ogólnych trendów grupowania, a klasyfikator Random Forest (RF) zostanie wykorzystany do grupowych analiz dyskryminacyjnych. Przeprowadzone zostaną również ukierunkowane analizy specyficznych cech metabolitów DESI-MS pochodzących z krótko- i długołańcuchowych kwasów tłuszczowych oraz amin biogennych, w przypadku których, jak wcześniej stwierdzono, korelują ze składem mikrobiomu pochwy oraz stanem aktywacji układu odpornościowego/zapalnego(2).