Sind das vaginale Mikrobiom und Metabolom mit der spontanen Frühgeburt (sPTB) bei Mehrlingsschwangerschaften verbunden? (SPRUCE)

BEGRÜNDUNG DER AKTUELLEN STUDIE

Der Mangel an Beweisen für den Nutzen einer Modalität zur Prävention von sPTB bei Mehrlingsschwangerschaften bedeutet, dass dringend neue Ansätze erforderlich sind, um diese große gesundheitliche Ungleichheit anzugehen. Trotz der zunehmenden Belege sowohl für das vaginale Mikrobiom als auch für das Metabolom der Vaginalschleimhaut und deren Zusammenhang mit sPTB wurden diese in keiner Studie bei Mehrlingsschwangerschaften analysiert. Weder wurde ein Unterschied zu Einlingsschwangerschaften festgestellt noch wurden einzigartige Zusammenhänge mit sPTB untersucht. Die Entdeckung neuer Zusammenhänge wird uns dabei helfen, Frauen mit dem höchsten sPTB-Risiko zuverlässig vorherzusagen und diejenigen zu identifizieren, die am wahrscheinlichsten von Screening und Intervention profitieren.

Das übergeordnete Ziel dieser Studie besteht darin, das vaginale Mikrobiom bei Mehrlingsschwangerschaften zu beurteilen, um festzustellen, ob es sich von Einlingsschwangerschaften unterscheidet, und die Ergebnisse mit unserer großen und einzigartigen Kohorte von Einlingsschwangerschaften mit niedrigem und hohem Risiko (Harris-Wellbeing Preterm Birth Centre) zu vergleichen. Darüber hinaus wird das Stoffwechselprofil der Vaginalschleimhaut bei Mehrlingsschwangerschaften beurteilt, wobei mit international anerkannten Kooperationspartnern zusammengearbeitet wird, um neuartige DESI-MS-Analysen zu nutzen. Diese Studie wird die erste sein, die sowohl das vaginale Mikrobiom als auch das Stoffwechselprofil der Vaginalschleimhaut bei Mehrlingsschwangerschaften untersucht und Zusammenhänge zwischen dem vaginalen Mikrobiom, Metabolom und sPTB in einer gut phänotypisierten Mehrlingsschwangerschaftspopulation bewertet. Darüber hinaus wird diese Studie die einzigartige Kohorte von Mehrlingsschwangerschaften nutzen, indem Blutproben und Messungen der Gebärmutterhalssteifigkeit für zukünftige explorative Analysen gesammelt werden, um letztendlich ein erfolgreiches Risikostratifizierungsmodell für Mehrlingsschwangerschaften zu entwickeln.

FORSCHUNGSFRAGE/ZIEL(E)

Beurteilung des vaginalen Mikrobioms bei Mehrlingsschwangerschaften im Vergleich zu Einlingsschwangerschaften mit geringem und hohem Risiko und Bewertung der Zusammenhänge zwischen vaginalem Mikrobiom, vaginalem Metabolom und sPTB.

ZIELE

Die SPRUCE-Studie verfolgt die folgenden Gesamtziele:

• Vergleich des vaginalen Mikrobioms von Mehrlingsschwangerschaften mit Einlingsschwangerschaften
• Beurteilung der Assoziation des vaginalen Mikrobioms mit sPTB bei Mehrlingsschwangerschaften
• Beurteilung der Assoziation des vaginalen Metaboloms mit sPTB bei Mehrlingsschwangerschaften

STUDIENDESIGN UND METHODEN DER DATENERHEBUNG

Eine prospektive Kohortenstudie an einem einzigen Standort mit 120 Frauen mit Mehrlingsschwangerschaften. Hohe Vaginalabstriche, Blutentnahmen und CL-Messungen werden in der 16. und 28. Schwangerschaftswoche durchgeführt. Die Steifheit des Gebärmutterhalses wird auch in der 16. Schwangerschaftswoche (während der Abstrichentnahme) gemessen. Bei Frauen mit intakten Membranen werden dann zu Beginn der Wehen/Einleitung/vor einem Kaiserschnitt (C/S) Vaginalabstriche entnommen (siehe Abbildung 1). Vaginalproben aller Frauen (n=120) werden durch 16S-rRNA-Gensequenzierung und -quantifizierung, metabolomisches Profiling, quantitative Candida-PCR und FFN charakterisiert, und Proben aus PTB-Fällen (ungefähr 23) und passenden Kontrollen werden zusätzlich einem metagenomischen Profiling unterzogen. Blutproben werden für zukünftige explorative Biomarker- und Proteomanalysen im Zusammenhang mit der Vorhersage von Frühgeburten aufbewahrt und Messungen der Zervixsteifheit werden für zukünftige Forschungen hinsichtlich möglicher Zusammenhänge mit Frühgeburten aufgezeichnet.

STUDIENDESIGN

Die Teilnehmer werden direkt von der Mehrlingsschwangerschaftsklinik (MPC) am LWH rekrutiert. Alle Frauen, die mit Zwillingen schwanger sind, erhalten bei der Buchung einer Schwangerschaftsvorsorge eine Patienteninformationsbroschüre und werden von einem Mitglied des Forschungsteams zu ihrem ersten Besuch im MPC in der 16. Schwangerschaftswoche eingeladen. An dieser Stelle erhalten sie weitere mündliche Informationen zur Studie und die Möglichkeit, Fragen zu stellen. Wenn die Frau der Teilnahme zustimmt, unterschreibt sie das studienspezifische Einverständnisformular und wird in einem maßgeschneiderten elektronischen Datenerfassungssystem registriert, das eine eindeutige Teilnehmeridentifikationsnummer generiert. Frauen dürfen solange entscheiden, ob sie an der Studie teilnehmen möchten. Wenn eine Frau mehr Zeit benötigt, um sich für die Teilnahme an der Studie zu entscheiden, wird ein weiterer Termin angeboten. Die Probenentnahme erfolgt erst nach Einwilligung des Teilnehmers.

Nach Einverständniserklärung werden Frauen gebeten, einen Gesundheitsfragebogen auszufüllen, der Informationen zur medizinischen und chirurgischen Vorgeschichte der Mutter, zu grundlegenden demografischen Daten und zum sozioökonomischen Hintergrund enthält. Anschließend werden sie gebeten, hohe Vaginalabstrichproben und Messungen der Zervixsteifheit (mittels Spekulumuntersuchung), Blutproben und CL-Messungen (mittels transvaginalen Ultraschall) bereitzustellen. Diese Untersuchungen werden in der 16. Schwangerschaftswoche durchgeführt. Vaginalabstriche, Blutproben und CL-Messungen werden in der 28. Schwangerschaftswoche wiederholt und weitere Vaginalabstriche werden bei Beginn der Wehen/Einleitung/vor dem Kaiserschnitt (CS) bei Frauen mit intakten Membranen entnommen. Vor jeder Blutentnahme und Spekulumuntersuchung füllen die Patienten einen kurzen Fragebogen aus, in dem sie angeben, ob sie aktuelle Medikamente einnehmen, kürzlich eine Antibiotika- und/oder Antimykotika-Behandlung durchgeführt haben oder Geschlechtsverkehr hatten. Wenn die Patientin in den letzten 48 Stunden vaginalen Geschlechtsverkehr hatte, wird die Probenentnahme auf einen späteren Termin verschoben.

Wenn nach 16 Wochen Hinweise auf eine verkürzte CL (<25 mm) vorliegen, wird die Patientin gemäß den örtlichen Richtlinien des Liverpool Women's Hospital (LWH) behandelt. Der Teilnehmer würde nicht von der Forschungsstudie ausgeschlossen und geplante Bewertungen würden weiterhin stattfinden.

Bei hohen Vaginalabstrichen wird die Patientin einer Spekulumuntersuchung unterzogen und die Abstriche werden unter direkter Sicht aus dem hinteren Fornix entnommen. Wenn zum Zeitpunkt der Entbindung Abstriche entnommen werden, werden diese vor der digitalen Vaginaluntersuchung durchgeführt. Die Messung der Zervixsteifheit wird gleichzeitig mit Vaginalabstrichen durchgeführt.

Nach der Rekrutierung bleiben die Teilnehmer bis zur Entbindung (in der Regel nicht später als 38 Wochen bei Zwillingsschwangerschaften) und der Entlassung aus dem Krankenhaus in der Studie. Routinemäßige klinische Daten werden aus den Notizen aller Teilnehmer und elektronischen Krankenhausakten für mütterliche und neonatale Ergebnisse gesammelt. Alle Studienbesuche fallen mit der Routineversorgung zusammen und alle teilnehmenden Frauen erhalten während ihrer gesamten Schwangerschaft routinemäßige Schwangerschaftsbetreuung gemäß den NICE-Schwangerschaftsrichtlinien für Zwillinge und Drillinge.

PROBENGRÖSSE

Die Klinik für Mehrlingsschwangerschaften am LWH führt jährlich 100 CL-Scans durch. Aufgrund der Akzeptanz eines CL-Scans wäre eine Rekrutierungsrate von 80 % zu erwarten. Über einen Zeitraum von 18 Monaten wäre daher mit einer konservativen Teilnehmerzahl von 120 zu rechnen.

Basierend auf der geschätzten Rate von Frühgeburten <34 Wochen von 19 % (LWH-Daten) wird ein geschätztes Maß an Präzision durch einen Standardfehler oder 3,6 % angegeben, was bedeutet, dass die Frühgeburtsrate mit einem 95 %-Konfidenzintervall geschätzt werden sollte, das durch definiert ist +-7 % Genauigkeit. Darüber hinaus sollte dies zu etwa 23 Frühgeburten innerhalb der Beobachtungskohorte führen, was multivariable Analysen einschließlich zweier Kovariaten ermöglichen wird, um die Stärke des Zusammenhangs zwischen interessierenden klinischen/demografischen Faktoren und der Frühgeburtsrate festzustellen.

ZIELPARAMETER

Das primäre Ergebnis wird eine sPTB <34 Schwangerschaftswoche sein. Prädiktoren für die vaginale Mikrobiota, die auf der 16S-rRNA-Gensequenzierung basieren, umfassen die gesamte vaginale Bakterienlast; Art der vaginalen Mikrobiota-Zusammensetzung; und vaginale relative Häufigkeit und geschätzte Konzentrationen von L. Crispatus, L. iners, allen Laktobazillen zusammen, allen BV-Anaerobiern zusammen und allen Pathobionten zusammen. Zu den weiteren Prädiktoren, die bei allen Frauen gemessen werden, zählen die vaginale Candida-Hefekonzentration, die FFN-Konzentration und metabolische Daten unter Verwendung von 20–30 metabolomischen Prädiktoren, die auf der Grundlage der Ergebnisse früherer Studien zu Einlingsschwangerschaften von David MacIntyre et al., Imperial College London, von Interesse sind. In der verschachtelten Fall-Kontroll-Studie werden mithilfe etablierter bioinformatischer Pipelines zusätzliche Prädiktoren aus Metagenomikdaten destilliert.

Sekundäre mütterliche und neonatale Ergebnisse werden für deskriptive Analysen aufgezeichnet:

• Mütterliche Ergebnisse: PPROM, mütterliche Infektion (erfordert eine intravenöse Antibiotikabehandlung bei Verdacht auf Chorioamnionitis), Schwangerschaft bei der Entbindung (<28 Wochen/<32 Wochen), Art der Entbindung, PTB-Behandlung.
• Neugeborenen-Ergebnisse: Schwangerschaftskomplikationen (TTTS/SFGR/TAPS), Lebendgeburt, fetaler/neonataler Tod, Geburtsgewicht, Neugeborenenmorbidität (IVH/NEC/ROP), Aufnahme auf die Neugeborenen-Intensivstation, Abhängigkeit von Beatmungsgeräten und Alter bei der Entlassung aus der Neugeborenen-Intensivstation.

STATISTISCHE METHODIK

Die vollständigen 16S-Mikrobiota-Daten (alle Bakterientaxa in allen Proben) werden zunächst in Heatmaps für alle Frauen sowie für Frauen mit und ohne sPTB visualisiert. Die Daten werden dann zur Verwendung in biostatistischen ätiologischen Modellen zusammengefasst, indem für jede einzelne Probe Folgendes berechnet wird: Geschätzte Konzentrationen von L. Crispatus, L. iners, allen Laktobazillen zusammen, allen BV-Anaerobiern zusammen, allen Pathobionten zusammen, allen Bakterien zusammen ( aus dem 16S-Gen qPCR) und allen Candida-Arten zusammen (auch durch qPCR); Alpha-Diversität (Inverser Simpson-Index); und Mikrobiota-Zusammensetzungstypen durch hierarchische Clusterbildung. Diese Mikrobiota-Variablen werden einzeln mithilfe der logistischen Regression getestet, wobei das Geburtsergebnis die abhängige Variable ist. Die Ergebnisse dieser Analysen werden auch mit den Ergebnissen ähnlicher Analysen in unseren bereits bestehenden Singleton-Kohorten mit hohem und niedrigem Risiko für Frühgeborene verglichen (1).

An den Metagenom- und Metabolom-Datensätzen werden unbeaufsichtigte und überwachte multivariate Analysen durchgeführt. Die anschließende Analyse mittels Hauptkomponentenanalyse (PCA) wird zur Visualisierung allgemeiner Clustering-Trends verwendet und ein Random Forest (RF)-Klassifikator wird für Gruppendiskriminierungsanalysen verwendet. Gezielte Analysen spezifischer DESI-MS-Metabolitenmerkmale, die aus kurz- und langkettigen Fettsäuren und biogenen Aminen stammen und von denen zuvor festgestellt wurde, dass sie mit der Zusammensetzung des vaginalen Mikrobioms und dem Immun-/Entzündungsaktivierungsstatus korrelieren, werden ebenfalls durchgeführt(2).