O microbioma e o metaboloma vaginal estão associados ao nascimento prematuro espontâneo (sPTB) em gestações múltiplas? (SPRUCE)

JUSTIFICATIVA PARA O ESTUDO ATUAL

A falta de evidências do benefício de qualquer modalidade de prevenção do sPTB em gestações múltiplas significa que são urgentemente necessárias novas abordagens para abordar esta importante desigualdade na saúde. Apesar das evidências crescentes sobre o microbioma vaginal e o metaboloma da mucosa vaginal e sua associação com sPTB, nenhum estudo os analisou em gestações múltiplas; nem determinar qualquer diferença em relação a gestações únicas nem explorar quaisquer associações únicas com sPTB. A descoberta de novas associações ajudará a nossa capacidade de prever com segurança as mulheres com maior risco de TBsPT e identificar aquelas com maior probabilidade de beneficiar do rastreio e da intervenção.

O objetivo geral deste estudo é avaliar o microbioma vaginal em gestações múltiplas para verificar se ele difere das gestações únicas, comparando os resultados com nossa grande e única coorte de filhos únicos de baixo e alto risco (Harris-Wellbeing Preterm Birth Centre). Além disso, o perfil metabólico da mucosa vaginal será avaliado em gestações múltiplas, trabalhando com colaboradores reconhecidos internacionalmente para utilizar novas análises DESI MS. Este estudo será o primeiro a avaliar o microbioma vaginal e o perfil metabólico da mucosa vaginal em gestações múltiplas e a avaliar associações entre o microbioma vaginal, metaboloma e sPTB em uma população de gestações múltiplas bem fenotipada. Além disso, este estudo utilizará a coorte única de gestações múltiplas, coletando amostras de sangue e medidas de rigidez cervical para análises exploratórias futuras, com o objetivo final de desenvolver um modelo de estratificação de risco bem-sucedido para gestações múltiplas.

PERGUNTA/OBJETIVO(S) DE PESQUISA

Avaliar o microbioma vaginal em gestações múltiplas em comparação com gestações únicas de baixo e alto risco e avaliar associações entre o microbioma vaginal, o metaboloma vaginal e o sPTB.

OBJETIVOS

O Estudo SPRUCE tem os seguintes objetivos gerais:

• Comparar o microbioma vaginal de gestações múltiplas com gestações únicas
• Avaliar a associação do microbioma vaginal ao sPTB em gestações múltiplas
• Avaliar a associação do metaboloma vaginal ao sPTB em gestações múltiplas

DESENHO DO ESTUDO E MÉTODOS DE COLETA DE DADOS

Um estudo de coorte prospectivo de local único com 120 mulheres com gravidez múltipla. Esfregaços vaginais elevados, coleta de sangue e medição de CL serão realizados na 16ª e 28ª semana de gestação. A rigidez cervical também será medida na 16ª semana de gestação (durante a coleta do esfregaço). Os esfregaços vaginais serão então coletados no início do trabalho de parto/indução/antes da cesariana (C/S) em mulheres com membranas intactas (ver Figura 1). Amostras vaginais de todas as mulheres (n = 120) serão caracterizadas por sequenciamento e quantificação do gene 16S rRNA, perfil metabolômico, PCR quantitativo de Candida e FFN, e amostras de casos de PTB (aproximadamente 23) e controles correspondentes serão adicionalmente submetidos a perfil metagenômico. Amostras de sangue serão armazenadas para futuros biomarcadores exploratórios e análises proteômicas relacionadas à previsão de nascimento prematuro e medições de rigidez cervical serão registradas para pesquisas futuras sobre suas associações potenciais com nascimento prematuro.

DESIGN DE ESTUDO

Os participantes serão recrutados diretamente na clínica de gravidez múltipla (MPC) da LWH. Todas as mulheres grávidas de gêmeos receberão um folheto informativo do paciente no momento da reserva para cuidados pré-natais e serão convidadas a participar em sua primeira visita ao MPC com 16 semanas de gestação por um membro da equipe de pesquisa. Neste ponto, eles receberão mais informações verbais sobre o estudo e terão a oportunidade de fazer perguntas. Se a mulher concordar em participar, ela assinará o formulário de consentimento informado específico do estudo e será registrada em um sistema eletrônico de captura de dados personalizado que irá gerar um número de identificação único do participante. As mulheres serão permitidas desde que desejem decidir se participarão do estudo. Se uma mulher precisar de mais tempo para decidir sobre a participação no estudo, será oferecida uma nova consulta. A coleta de amostras só será organizada após o consentimento do participante.

Após consentimento informado, as mulheres serão solicitadas a preencher um questionário de saúde fornecendo informações sobre histórico médico e cirúrgico materno, dados demográficos básicos e antecedentes socioeconômicos. Eles serão então solicitados a fornecer amostras de esfregaço vaginal alto e medições de rigidez cervical (por meio de exame com espéculo), amostras de sangue e medições de CL (por meio de ultrassom transvaginal). Essas avaliações serão realizadas com 16 semanas de gestação. Esfregaços vaginais, amostras de sangue e medição de CL serão repetidos na 28ª semana de gestação e outros esfregaços vaginais serão coletados no início do trabalho de parto/indução/antes da cesariana (CS) em mulheres com membranas intactas. Antes de cada coleta de sangue e exame com espéculo, os pacientes preencherão um breve questionário informando se algum medicamento atual, tratamento antibiótico e/ou antifúngico recente ou relação sexual. Caso a paciente tenha tido relação sexual vaginal nas últimas 48 horas, a coleta da amostra será adiada para uma consulta posterior.

Se houver evidência de CL encurtado (<25 mm) em 16 semanas, o paciente será tratado de acordo com a política local do Liverpool Women's Hospital (LWH). O participante não seria excluído da pesquisa e as avaliações planejadas ainda ocorreriam.

Para esfregaços vaginais altos, a paciente será submetida a um exame com espéculo e os esfregaços serão coletados sob visão direta do fórnice posterior. Se forem coletados esfregaços no momento do parto, eles serão realizados antes do exame digital vaginal. A medição da rigidez cervical será realizada simultaneamente com esfregaços vaginais.

Uma vez recrutados, os participantes permanecerão no estudo até o parto (normalmente, no máximo 38 semanas em qualquer gravidez gemelar) e alta hospitalar. Os dados clínicos de rotina serão coletados de anotações de todos os participantes e registros hospitalares eletrônicos para resultados maternos e neonatais. Todas as visitas do estudo coincidirão com os cuidados de rotina e todas as mulheres participantes receberão cuidados pré-natais de rotina de acordo com as diretrizes do NICE para gravidez de gêmeos e trigêmeos durante a gravidez.

TAMANHO DA AMOSTRA

A Clínica de Gravidez Múltipla da LWH realiza 100 exames de CL anualmente. Seria esperada uma taxa de recrutamento de 80% devido à aceitabilidade de um exame de CL. Ao longo de um período de 18 meses seriam, portanto, esperados 120 participantes conservadores.

Com base na taxa estimada de partos prematuros <34 semanas de 19% (dados de LWH), então um nível estimado de precisão é dado por um erro padrão ou 3,6%, o que significa que a taxa de partos prematuros deve ser estimada com um intervalo de confiança de 95% definido por +-7% de grau de precisão. Além disso, isso deve levar a aproximadamente 23 partos prematuros dentro da coorte observacional, o que permitirá análises multivariáveis, incluindo 2 covariáveis, para estabelecer a força da associação entre fatores clínicos/demográficos de interesse em relação à taxa de partos precoces.

MEDIDAS DE RESULTADO

O resultado primário será sPTB <34 semanas de gestação. Os preditores da microbiota vaginal baseados no sequenciamento do gene 16S rRNA incluirão carga bacteriana vaginal total; tipo de composição da microbiota vaginal; e abundância relativa vaginal e concentrações estimadas de L. crispatus, L. iners, todos os lactobacilos combinados, todos os anaeróbios BV combinados e todos os patobiontes combinados. Os preditores adicionais medidos em todas as mulheres incluirão a concentração vaginal de leveduras Candida, a concentração de FFN e dados metabolômicos usando 20-30 preditores metabolômicos que são de interesse com base nos resultados de estudos anteriores em gestações únicas por David MacIntyre et al, Imperial College London. No estudo de caso-controle aninhado, preditores adicionais serão destilados de dados metagenômicos usando pipelines de bioinformática estabelecidos.

Os resultados maternos e neonatais secundários serão registrados para análises descritivas:

• Desfechos maternos: PPROM, infecção materna (requer tratamento com antibióticos intravenosos para suspeita de corioamnionite), gestação no parto (<28 semanas/<32 semanas), tipo de parto, tratamento de TBP.
• Desfechos neonatais: complicações na gravidez (TTTS/SFGR/TAPS), nascidos vivos, morte fetal/neonatal, peso ao nascer, morbidade neonatal (IVH/NEC/ROP), internação na UTIN, dependência de ventilador e idade na alta da UTIN.

METODOLOGIA ESTATÍSTICA

Os dados completos da microbiota 16S (todos os táxons bacterianos em todas as amostras) serão primeiro visualizados em mapas de calor para todas as mulheres e para mulheres com e sem sPTB. Os dados serão então resumidos para uso em modelos etiológicos bioestatísticos, calculando o seguinte para cada amostra individual: Concentrações estimadas de L. crispatus, L. iners, todos os lactobacilos combinados, todos os anaeróbios BV combinados, todos os patobiontes combinados, todas as bactérias combinadas ( do gene 16S qPCR) e todas as espécies de Candida combinadas (também por qPCR); diversidade alfa (índice de Simpson inverso); e tipos de composição da microbiota por agrupamento hierárquico. Essas variáveis ​​​​da microbiota serão testadas uma de cada vez usando regressão logística com resultado do nascimento como variável dependente. Os resultados dessas análises também serão comparados com os resultados de análises semelhantes em nossas coortes pré-existentes de filhos únicos prematuros de alto e baixo risco (1).

Análises multivariadas supervisionadas e não supervisionadas serão realizadas nos conjuntos de dados de metagenoma e metaboloma. A análise subsequente usando análise de componentes principais (PCA) será usada para visualização de tendências gerais de agrupamento e um classificador Random Forest (RF) será usado para análises discriminatórias de grupo. Também serão realizadas análises direcionadas de características específicas de metabólitos DESI-MS derivados de ácidos graxos de cadeia curta e longa e aminas biogênicas que foram previamente correlacionadas com a composição do microbioma vaginal e o status de ativação imunológica/inflamatória(2).