질 미생물군집과 대사체는 다태 임신에서 자연 조산(sPTB)과 연관되어 있습니까? (SPRUCE)

현재 연구의 이론적 근거

다태 임신에서 sPTB 예방을 위한 어떤 방식의 이점에 대한 증거가 부족하다는 것은 이러한 주요 건강 불평등을 해결하기 위해 새로운 접근 방식이 시급히 필요하다는 것을 의미합니다. 질 미생물군집과 질 점막 대사체 및 sPTB와의 연관성에 대한 증거가 늘어나고 있음에도 불구하고 다태 임신에서 이를 분석한 연구는 없습니다. 단태 임신과의 차이점을 판단하거나 sPTB와의 고유한 연관성을 탐색하지도 않습니다. 새로운 연관성을 발견하면 sPTB 위험이 가장 높은 여성을 안정적으로 예측하고 선별검사 및 개입으로 가장 큰 혜택을 받을 가능성이 가장 높은 여성을 식별하는 능력에 도움이 될 것입니다.

이 연구의 전반적인 목표는 다태 임신의 질 미생물군집을 평가하여 단태 임신과 다른지 확인하고 그 결과를 저위험 및 고위험 단태로 구성된 대규모 고유 코호트(Harris-Wellbeing Preterm Birth Centre)와 비교하는 것입니다. 또한 새로운 DESI MS 분석을 활용하기 위해 국제적으로 인정받는 협력자들과 협력하여 다태 임신에서 질 점막의 대사 프로필을 평가할 예정입니다. 이 연구는 다태 임신에서 질 미생물군집과 질 점막 대사 프로필을 모두 평가하고 잘 표현형이 지정된 다태 임신 인구에서 질 미생물군집, 대사체 및 sPTB 간의 연관성을 평가하는 최초의 연구입니다. 또한, 이 연구는 향후 탐색적 분석을 위해 혈액 샘플 및 자궁 경부 강성 측정을 수집하여 다태 임신의 독특한 코호트를 활용하여 궁극적으로 다태 임신에 대한 성공적인 위험 계층화 모델을 개발하는 것을 목표로 합니다.

연구 질문/목표

저위험 및 고위험 단태 임신과 비교하여 다태 임신에서 질 미생물군집을 평가하고 질 미생물군집, 질 대사체 및 sPTB 간의 연관성을 평가합니다.

목표

SPRUCE 연구의 전반적인 목표는 다음과 같습니다.

• 다태 임신과 단태 임신의 질 미생물군집을 비교하려면
• 다태 임신에서 질 미생물군집과 sPTB의 연관성을 평가합니다.
• 다태 임신에서 질 대사체와 sPTB의 연관성을 평가합니다.

연구 설계 및 데이터 수집 방법

다태 임신을 한 여성 120명을 대상으로 한 단일 현장 전향적 코호트 연구입니다. 높은 질 면봉 채취, 혈액 샘플링 및 CL 측정은 임신 16주 및 28주에 수행됩니다. 자궁 경부 경직도 임신 16주차(면봉 수집 중)에 측정됩니다. 그런 다음 질 면봉은 막이 온전한 여성의 경우 분만/유도 시작 시/제왕절개(C/S) 이전에 수집됩니다(그림 1 참조). 모든 여성(n=120)의 질 샘플은 16S rRNA 유전자 서열분석 및 정량화, 대사체 프로파일링, 칸디다 정량적 PCR 및 FFN을 특징으로 하며, PTB 사례(약 23명) 및 일치하는 대조군의 샘플은 추가로 메타게놈 프로파일링을 수행합니다. 혈액 샘플은 미래의 탐색적 바이오마커 및 조산 예측과 관련된 단백질체 분석을 위해 저장될 것이며, 자궁 경부 강성 측정은 조산과의 잠재적 연관성에 관한 향후 연구를 위해 기록될 것입니다.

연구 설계

참가자는 LWH의 다태 임신 클리닉(MPC)에서 직접 모집됩니다. 쌍둥이를 임신한 모든 여성은 산전 관리 예약 시 환자 정보 전단지를 받게 되며, 임신 16주차에 MPC를 처음 방문할 때 연구팀 구성원의 초대를 받아 참여하게 됩니다. 이 시점에서 그들은 연구에 대한 추가 구두 정보를 받고 질문할 기회를 갖게 됩니다. 여성이 참여에 동의하면 특정 연구 동의서에 서명하고 고유한 참가자 식별 번호를 생성하는 맞춤형 전자 데이터 캡처 시스템에 등록됩니다. 여성이 연구 참여 여부를 결정하기를 원하는 한 허용됩니다. 여성이 연구 참여를 결정하는 데 추가 시간이 필요한 경우 추가 약속이 제공됩니다. 샘플 수집은 참가자가 동의한 경우에만 이루어집니다.

사전 동의 후 여성은 산모의 의료 및 수술 이력, 기본 인구통계 및 사회경제적 배경에 대한 정보를 제공하는 건강 설문지를 작성해야 합니다. 그런 다음 질 면봉 샘플과 경부 경직도 측정(검경 검사를 통해), 혈액 샘플 및 CL 측정(질경유 초음파를 통해)을 제공하라는 요청을 받습니다. 이러한 평가는 임신 16주에 실시됩니다. 질 면봉, 혈액 샘플 및 CL 측정은 임신 28주에 반복되며, 막이 온전한 여성의 경우 분만/유도 시작 시/제왕절개(CS) 이전에 추가 질 면봉이 수집됩니다. 각 혈액 수집 및 검경 검사에 앞서 환자는 현재 복용 중인 약물, 최근 항생제 및/또는 항진균 치료 또는 성교 여부를 명시하는 간단한 설문지를 작성합니다. 환자가 지난 48시간 동안 질 성교를 했다면 샘플 수집은 나중 약속으로 연기됩니다.

16주차에 CL 단축(<25mm)의 증거가 있는 경우 환자는 지역 리버풀 여성병원(LWH) 정책에 따라 치료를 받게 됩니다. 참가자는 연구 조사에서 제외되지 않으며 계획된 평가는 계속 진행됩니다.

높은 질 면봉의 경우 환자는 검경 검사를 받고 면봉은 후방 fornix에서 직접 관찰하여 채취됩니다. 분만 시 면봉을 채취하는 경우 디지털 질 검사 전에 채취합니다. 질 면봉 채취와 동시에 자궁 경부 강성 측정이 이루어집니다.

일단 모집되면 참가자는 출산(일반적으로 쌍둥이 임신의 경우 38주 이내) 및 병원에서 퇴원할 때까지 연구에 계속 참여하게 됩니다. 모든 참가자의 메모와 산모 및 신생아 결과에 대한 전자 병원 기록에서 일상적인 임상 데이터가 수집됩니다. 모든 연구 방문은 정기 진료와 동시에 이루어지며, 참여하는 모든 여성은 임신 기간 동안 NICE 쌍둥이 및 삼중 임신 지침에 따라 정기 산전 진료를 받게 됩니다.

표본의 크기

LWH의 다태 임신 클리닉에서는 매년 100회의 CL 스캔을 수행합니다. CL 스캔의 수용 가능성으로 인해 채용 비율은 80%로 예상됩니다. 따라서 18개월 동안 보수적으로 120명의 참가자가 예상됩니다.

34주 미만의 조기 분만 추정 비율 19%(LWH 데이터)에 기초하여 추정 정밀도 수준은 표준 오차 또는 3.6%로 제공됩니다. 이는 조기 분만 비율이 다음으로 정의된 95% 신뢰 구간으로 추정되어야 함을 의미합니다. +-7% 정밀도. 또한 이는 관찰 코호트 내에서 대략 23개의 조기 분만으로 이어져야 하며, 이는 조기 분만률에 대한 관심 있는 임상/인구통계학적 요인 사이의 연관성 강도를 확립하기 위해 2개의 공변량을 포함하는 다변량 분석을 허용할 것입니다.

결과 측정

일차 결과는 임신 34주 미만의 sPTB입니다. 16S rRNA 유전자 염기서열분석을 기반으로 한 질 미생물군 예측변수에는 총 질 박테리아 부하; 질 미생물총 구성 유형; L. 크리스파투스, L. 이너스, 모든 유산균 결합, 모든 BV-혐기성균 결합 및 모든 병원균 결합의 질 상대 풍부도 및 추정 농도. 모든 여성에서 측정되는 추가 예측 변수에는 질 칸디다 효모 농도, FFN 농도 및 David MacIntyre 외 Imperial College London의 단태 임신에 대한 이전 연구 결과를 기반으로 관심 있는 20-30개의 대사 예측 변수를 사용한 대사 데이터가 포함됩니다. 중첩된 사례 관리 연구에서는 확립된 생물정보학 파이프라인을 사용하여 메타게놈학 데이터에서 추가 예측 변수가 추출됩니다.

설명적 분석을 위해 이차 산모 및 신생아 결과가 기록됩니다.

• 산모 결과: PPROM, 산모 감염(융모막염이 의심되는 경우 IV 항생제 치료 필요), 분만 시 임신(<28주/<32주), 분만 방식, PTB 치료.
• 신생아 결과: 임신 합병증(TTTS/SFGR/TAPS), 출생, 태아/신생아 사망, 출생 체중, 신생아 이환율(IVH/NEC/ROP), NICU 입원, 인공호흡기 의존성 및 NICU 퇴원 연령.

통계적 방법론

전체 16S 미생물군 데이터(모든 샘플의 모든 박테리아 분류군)는 먼저 모든 여성과 sPTB 유무에 관계없이 히트맵으로 시각화됩니다. 그런 다음 데이터는 각 개별 샘플에 대해 다음을 계산하여 생물통계적 병인학 모델에 사용하기 위해 요약됩니다. L. 크리스파투스, L. 이너스, 모든 유산균 결합, 모든 BV-혐기성균 결합, 모든 병원균 결합, 모든 박테리아 결합의 추정 농도( 16S 유전자 qPCR로부터) 및 모든 칸디다 종 결합(또한 qPCR에 의해); 알파 다양성(역 심슨 지수); 계층 적 클러스터링을 통한 미생물 총 구성 유형. 이러한 미생물군 변수는 출생 결과를 종속 변수로 하는 로지스틱 회귀를 사용하여 한 번에 하나씩 테스트됩니다. 이러한 분석 결과는 기존의 고위험 및 저위험 미숙아 싱글톤 코호트(1)의 유사한 분석 결과와도 비교됩니다.

비지도 및 지도 다변량 분석은 메타게놈 및 대사체 데이터 세트에 대해 수행됩니다. 일반적인 군집화 경향을 시각화하기 위해 주성분 분석(PCA)을 사용한 후속 분석을 사용하고 그룹 차별 분석을 위해 RF(Random Forest) 분류기를 사용합니다. 이전에 질 미생물군집 구성 및 면역/염증 활성화 상태와 상관관계가 있는 것으로 밝혀진 단쇄 및 장쇄 지방산과 생체 아민에서 파생된 특정 DESI-MS 대사산물 특징에 대한 표적 분석도 수행됩니다(2).