Er det vaginale mikrobiomet og metabolomet assosiert med spontan prematur fødsel (sPTB) i multiple graviditeter? (SPRUCE)

BAKGRUNN FOR AKTUELT STUDIE

Mangelen på bevis for nytte av enhver modalitet for forebygging av sPTB i flere graviditeter betyr at nye tilnærminger er tvingende nødvendig for å håndtere denne store helseulikheten. Til tross for økende bevis angående både vaginalt mikrobiom og vaginalslimhinnemetabolom og dets assosiasjon med sPTB, har ingen studier analysert disse i flere graviditeter; verken bestemme noen forskjell til singleton graviditeter eller utforske noen unike assosiasjoner med sPTB. Å oppdage nye assosiasjoner vil hjelpe vår evne til å pålitelig forutsi kvinner med høyest risiko for sPTB og identifisere de som mest sannsynlig vil ha nytte av screening og intervensjon.

Det overordnede målet med denne studien er å vurdere det vaginale mikrobiomet i multiple graviditeter for å finne ut om det skiller seg fra singleton-svangerskap, ved å sammenligne resultatene med vår store og unike kohort av lav- og høyrisiko-singlebarn (Harris-Wellbeing Preterm Birth Centre). I tillegg vil den metabolske profilen til vaginalslimhinnen bli vurdert i flere graviditeter, i samarbeid med internasjonalt anerkjente samarbeidspartnere for å bruke ny DESI MS-analyse. Denne studien vil være den første som vurderer både det vaginale mikrobiomet og den vaginale mukosale metabolske profilen i flere graviditeter og for å evaluere assosiasjoner mellom det vaginale mikrobiomet, metabolomet og sPTB i en godt fenotypet multippelgraviditetspopulasjon. Videre vil denne studien utnytte den unike kohorten av flere graviditeter ved å samle inn blodprøver og målinger av livmorhalsstivhet for fremtidig eksplorativ analyse, med sikte på å utvikle en vellykket risikostratifiseringsmodell for multippelgraviditeter.

FORSKNINGSSPØRSMÅL/MÅL

For å vurdere det vaginale mikrobiomet i flere graviditeter sammenlignet med lav- og høyrisiko singleton-svangerskap og for å evaluere assosiasjoner mellom det vaginale mikrobiomet, vaginale metabolomet og sPTB.

MÅL

SPRUCE-studien har følgende overordnede mål:

• For å sammenligne det vaginale mikrobiomet av flergangsgraviditeter med singleton-svangerskap
• For å vurdere assosiasjonen av det vaginale mikrobiomet til sPTB i flere graviditeter
• For å vurdere assosiasjonen av det vaginale metabolomet til sPTB i flere graviditeter

STUDIEDESIGN OG METODER FOR DATAINNSAMLING

En enkeltsteds prospektiv kohortstudie av 120 kvinner med flere graviditeter. Høye vaginale vattpinner, blodprøvetaking og CL-måling vil bli utført ved 16 og 28 ukers svangerskap. Stivhet i livmorhalsen vil også bli målt ved 16 ukers svangerskap (under innsamling av vattpinne). Vaginale vattpinner vil da bli tatt ved start av fødsel/induksjon/før keisersnitt (C/S) hos kvinner med intakte membraner (Se figur 1). Vaginale prøver fra alle kvinner (n=120) vil bli karakterisert av 16S rRNA-gensekvensering og kvantifisering, metabolomisk profilering, Candida kvantitativ PCR og FFN, og prøver fra PTB-tilfeller (ca. 23) og matchede kontroller vil i tillegg gjennomgå metagenomisk profilering. Blodprøver vil bli lagret for fremtidig utforskende biomarkør og proteomisk analyse knyttet til preterm fødselsprediksjon og målinger av livmorhalsstivhet vil bli registrert for fremtidig forskning angående potensielle assosiasjoner til prematur fødsel.

STUDERE DESIGN

Deltakerne vil bli rekruttert direkte fra multippelgraviditetsklinikken (MPC) ved LWH. Alle kvinner gravide med tvillinger vil motta en pasientinformasjon ved bestilling av svangerskapsomsorg og vil bli invitert til å delta ved sitt første besøk til MPC ved 16 ukers svangerskap av et medlem av forskerteamet. På dette tidspunktet vil de motta ytterligere muntlig informasjon om studien og en mulighet til å stille spørsmål. Hvis kvinnen godtar å delta, vil de signere det studiespesifikke informerte samtykkeskjemaet og bli registrert på et skreddersydd elektronisk datafangstsystem som vil generere et unikt deltakeridentifikasjonsnummer. Kvinner vil få lov så lenge de ønsker å bestemme om de vil delta i studien. Dersom en kvinne trenger mer tid til å bestemme seg for deltakelse i studien vil det bli tilbudt en ny time. Prøvetaking vil først bli arrangert når deltakeren har samtykket.

Etter informert samtykke vil kvinner bli bedt om å fylle ut et helsespørreskjema som gir informasjon om mors medisinske og kirurgiske historie, grunnleggende demografi og sosioøkonomisk bakgrunn. De vil da bli bedt om å gi høye vaginale vattpinneprøver og målinger av livmorhalsstivhet (via spekulumundersøkelse), blodprøver og CL-målinger (via transvaginal ultralyd). Disse vurderingene vil bli utført ved 16 ukers svangerskap. Vaginale vattpinner, blodprøver og CL-måling vil bli gjentatt ved 28 ukers svangerskap, og ytterligere vaginale vattpinner vil bli tatt ved start av fødsel/induksjon/før keisersnitt (CS) hos kvinner med intakte membraner. Før hver innsamling av blod- og spekulumundersøkelse vil pasienter fylle ut et kort spørreskjema som opplyser om aktuelle medisiner, nylig antibiotika- og/eller antifungal behandling eller samleie. Dersom pasienten har hatt vaginalt samleie de siste 48 timer vil prøvetaking bli utsatt til en senere avtale.

Hvis det er tegn på en forkortet CL (<25 mm) etter 16 uker, vil pasienten bli behandlet i henhold til lokale Liverpool Women's Hospital (LWH) retningslinjer. Deltakeren vil ikke bli ekskludert fra forskningsstudien og planlagte vurderinger vil fortsatt finne sted.

For høye vaginale vattpinner vil pasienten gjennomgå en spekulumundersøkelse og vattpinner vil bli tatt under direkte syn fra posterior fornix. Hvis vattpinner tas ved leveringstidspunktet, vil de bli utført før digital vaginal undersøkelse. Måling av livmorhalsstivhet vil bli tatt samtidig sammen med vaginale vattpinner.

Når de er rekruttert, vil deltakerne forbli i studien frem til fødsel (rutinemessig ikke senere enn 38 uker i tvillinggraviditeter) og utskrivning fra sykehus. Rutinemessige kliniske data vil bli samlet inn fra alle deltakernes notater og elektroniske sykehusjournaler for mors- og neonatale utfall. Alle studiebesøk vil falle sammen med rutinemessig omsorg og alle deltakende kvinner vil motta rutinemessig svangerskapsomsorg i henhold til NICEs retningslinjer for tvilling- og trillinggraviditet gjennom hele svangerskapet.

PRØVE STØRRELSE

Multiple Graviditetsklinikken ved LWH utfører 100 CL-skanninger årlig. En rekrutteringsrate på 80 % kan forventes på grunn av akseptabiliteten av en CL-skanning. I løpet av en 18-måneders periode vil man derfor forvente konservative 120 deltakere.

Basert på den estimerte frekvensen av premature fødsel <34 uker på 19 % (LWH-data), er et estimert presisjonsnivå gitt ved en standardfeil eller 3,6 %, noe som betyr at den tidlige fødselsraten bør estimeres med et 95 % konfidensintervall definert av +-7 % grad av presisjon. Videre bør dette føre til omtrent 23 premature fødsler innenfor observasjonskohorten som vil tillate multivariable analyser inkludert 2 kovariater for å fastslå styrken på assosiasjonen mellom kliniske/demografiske faktorer av interesse mot tidlig fødselsrate.

UTFALLSMÅL

Det primære resultatet vil være sPTB <34 ukers svangerskap. Vaginale mikrobiota-prediktorer basert på 16S rRNA-gensekvensering vil inkludere total vaginal bakteriell belastning; vaginal mikrobiota sammensetning type; og vaginal relativ overflod og estimerte konsentrasjoner av L. crispatus, L. iners, alle laktobaciller kombinert, alle BV-anaerober kombinert og alle patobionter kombinert. Ytterligere prediktorer som måles hos alle kvinner vil inkludere vaginal Candida-gjærkonsentrasjon, FFN-konsentrasjon og metabolomiske data ved bruk av 20-30 metabolomiske prediktorer som er av interesse basert på resultatene fra tidligere studier i singleton-svangerskap av David MacIntyre et al, Imperial College London. I den nestede case-control-studien vil ytterligere prediktorer bli destillert fra metagenomikkdata ved bruk av etablerte bioinformatiske rørledninger.

Sekundære mors- og neonatale utfall vil bli registrert for beskrivende analyser:

• Maternal utfall: PPROM, maternal infeksjon (krever IV antibiotikabehandling ved mistanke om chorioamnionitt), svangerskap ved fødsel (<28 uker/<32 uker), fødselsmåte, PTB-behandling.
• Neonatale utfall: svangerskapskomplikasjoner (TTTS/SFGR/TAPS), livfødsel, føtal/neonatal død, fødselsvekt, neonatal sykelighet (IVH/NEC/ROP), innleggelse på NICU, respiratoravhengighet og alder ved utskrivning på NICU.

STATISTISK METODOLOGI

De fullstendige 16S mikrobiotadataene (alle bakterielle taxaer i alle prøver) vil først bli visualisert i varmekart for alle kvinner og for kvinner med og uten sPTB. Dataene vil deretter bli oppsummert for bruk i biostatistiske etiologiske modeller ved å beregne følgende for hver enkelt prøve: Estimerte konsentrasjoner av L. crispatus, L. iners, alle laktobaciller kombinert, alle BV-anaerober kombinert, alle patobionter kombinert, alle bakterier kombinert ( fra 16S-genet qPCR) og alle Candida-arter kombinert (også ved qPCR); alfa-diversitet (Inverse Simpson-indeks); og mikrobiota-sammensetningstyper ved hierarkisk klynging. Disse mikrobiotavariablene vil bli testet en om gangen ved å bruke logistisk regresjon med fødselsutfall som avhengig variabel. Resultatene av disse analysene vil også bli sammenlignet med resultatene av lignende analyser i våre pre-eksisterende høy- og lavrisiko premature singleton-kohorter (1).

Uovervåket og overvåket multivariate analyser vil bli utført på metagenom- og metabolom-datasettene. Påfølgende analyse ved bruk av prinsipiell komponentanalyse (PCA) vil bli brukt for visualisering av generelle clustering-trender og en Random Forest (RF) klassifisering vil bli brukt for gruppediskriminerende analyser. Målrettede analyser av spesifikke DESI-MS-metabolittegenskaper avledet fra kort- og langkjedede fettsyrer og biogene aminer som tidligere er funnet å korrelere med vaginal mikrobiomsammensetning og immun/inflammatorisk aktiveringsstatus vil også bli utført(2).