Je vaginální mikrobiom a metabolom spojen se spontánním předčasným porodem (sPTB) u vícečetných těhotenství? (SPRUCE)

ODŮVODNĚNÍ AKTUÁLNÍ STUDIE

Nedostatek důkazů o přínosu jakékoli modality prevence sPTB u vícečetných těhotenství znamená, že k řešení této velké zdravotní nerovnosti jsou naléhavě zapotřebí nové přístupy. Navzdory rostoucím důkazům týkajícím se jak vaginálního mikrobiomu, tak metabolomu vaginální sliznice a jejich spojení se sPTB, žádná studie je neanalyzovala u vícečetných těhotenství; ani určení rozdílu od jednočetných těhotenství ani zkoumání jakýchkoli jedinečných souvislostí se sPTB. Objevení nových souvislostí pomůže naší schopnosti spolehlivě předvídat ženy s nejvyšším rizikem sPTB a identifikovat ty, které budou mít ze screeningu a intervence největší prospěch.

Celkovým cílem této studie je posoudit vaginální mikrobiom u vícečetných těhotenství, abychom zjistili, zda se liší od jednočetných těhotenství, porovnáním výsledků s naší velkou a jedinečnou kohortou s nízkým a vysokým rizikem jednočetných těhotenství (Harris-Wellbeing Preterm Birth Center). Metabolický profil vaginální sliznice bude navíc hodnocen u vícečetných těhotenství ve spolupráci s mezinárodně uznávanými spolupracovníky na využití nové DESI MS analýzy. Tato studie bude první, která zhodnotí jak vaginální mikrobiom, tak metabolický profil vaginální sliznice u vícečetných těhotenství a vyhodnotí asociace mezi vaginálním mikrobiomem, metabolomem a sPTB u populace s dobře fenotypovaným vícečetným těhotenstvím. Kromě toho bude tato studie využívat jedinečnou kohortu vícečetných těhotenství odběrem vzorků krve a měřením cervikální tuhosti pro budoucí průzkumnou analýzu, s konečným cílem vyvinout úspěšný model stratifikace rizika pro vícečetná těhotenství.

VÝZKUMNÁ OTÁZKA/CÍL

Posoudit vaginální mikrobiom u vícečetných těhotenství ve srovnání s nízkorizikovým a vysoce rizikovým jednočetným těhotenstvím a vyhodnotit souvislosti mezi vaginálním mikrobiomem, vaginálním metabolomem a sPTB.

CÍLE

Studie SPRUCE má tyto celkové cíle:

• Porovnat vaginální mikrobiom vícečetných těhotenství s jednočetným těhotenstvím
• Posoudit asociaci vaginálního mikrobiomu se sPTB u vícečetných těhotenství
• Posoudit asociaci vaginálního metabolomu se sPTB u vícečetných těhotenství

NÁVRH STUDIE A ZPŮSOBY SBĚRU DAT

Jednomístná prospektivní kohortová studie se 120 ženami s vícečetným těhotenstvím. Vysoké vaginální výtěry, odběr krve a měření CL budou provedeny v 16. a 28. týdnu gestace. Cervikální ztuhlost bude také měřena v 16. týdnu těhotenství (během odběru výtěru). Vaginální výtěry se pak odeberou na začátku porodu/vyvolání/před císařským řezem (C/S) u žen s intaktní membránou (viz obrázek 1). Vaginální vzorky od všech žen (n=120) budou charakterizovány sekvenováním a kvantifikací genu 16S rRNA, metabolomickým profilováním, kvantitativní PCR Candida a FFN a vzorky z případů PTB (přibližně 23) a odpovídající kontroly budou navíc podrobeny metagenomickému profilování. Vzorky krve budou uchovávány pro budoucí explorativní biomarker a proteomická analýza týkající se predikce předčasného porodu a měření cervikální tuhosti budou zaznamenána pro budoucí výzkum týkající se jejich potenciálních souvislostí s předčasným porodem.

STUDOVAT DESIGN

Účastnice se budou rekrutovat přímo z kliniky pro vícečetné těhotenství (MPC) na LWH. Všechny ženy těhotné s dvojčaty obdrží informační leták pro pacienty při rezervaci prenatální péče a budou pozvány k účasti na první návštěvě MPC v 16. týdnu těhotenství členem výzkumného týmu. V tomto okamžiku obdrží další ústní informace o studiu a příležitost klást otázky. Pokud žena souhlasí s účastí, podepíše formulář informovaného souhlasu specifického pro studii a bude zaregistrována do elektronického systému sběru dat na míru, který vygeneruje jedinečné identifikační číslo účastníka. Ženy se budou moci rozhodnout, zda se studie zúčastní, dokud si budou přát. Pokud žena potřebuje více času na rozhodnutí o účasti ve studii, bude nabídnuta další schůzka. Odběr vzorků bude zorganizován pouze se souhlasem účastníka.

Po informovaném souhlasu budou ženy požádány, aby vyplnily zdravotní dotazník poskytující informace o lékařské a chirurgické anamnéze matky, základním demografickém a socioekonomickém pozadí. Poté budou požádáni, aby poskytli vysoké vzorky vaginálního výtěru a měření cervikální tuhosti (prostřednictvím vyšetření spekulem), vzorky krve a měření CL (prostřednictvím transvaginálního ultrazvuku). Tato hodnocení budou provedena v 16. týdnu těhotenství. Vaginální výtěry, krevní vzorky a měření CL budou opakovány ve 28. týdnu gestace a další vaginální výtěry budou odebrány na začátku porodu/vyvolání/před císařským řezem (CS) u žen s intaktní membránou. Před každým odběrem krve a vyšetřením zrcátka pacienti vyplní krátký dotazník, ve kterém uvedou, zda v současné době užívá léky, nedávnou léčbu antibiotiky a/nebo antimykotiky nebo pohlavní styk. Pokud měla pacientka během posledních 48 hodin vaginální pohlavní styk, odběr vzorku bude odložen na pozdější schůzku.

Pokud existuje důkaz o zkrácení CL (<25 mm) v 16. týdnu, pacient bude léčen podle místních zásad Liverpool Women's Hospital (LWH). Účastník by nebyl vyloučen z výzkumné studie a plánovaná hodnocení by stále probíhala.

U vysokých vaginálních výtěrů pacientka podstoupí vyšetření zrcátka a výtěry budou odebrány pod přímým viděním ze zadního fornixu. Pokud jsou výtěry odebírány v době porodu, budou provedeny před digitálním vaginálním vyšetřením. Měření cervikální tuhosti bude provedeno současně s vaginálními výtěry.

Po náboru účastníci zůstanou ve studii až do porodu (běžně ne později než 38 týdnů u jakéhokoli dvojčetného těhotenství) a propuštění z nemocnice. Rutinní klinická data budou shromažďována z poznámek všech účastníků a elektronických nemocničních záznamů pro výsledky matek a novorozenců. Všechny studijní návštěvy se budou shodovat s běžnou péčí a všem zúčastněným ženám bude po celou dobu těhotenství poskytnuta běžná prenatální péče podle pokynů NICE pro dvojčata a trojčata.

VELIKOST VZORKU

Klinika vícečetného těhotenství na LWH provádí ročně 100 CL skenů. Vzhledem k přijatelnosti CL skenu by se očekávala míra náboru 80 %. Během 18měsíčního období by se proto očekávalo konzervativních 120 účastníků.

Na základě odhadované míry předčasných porodů <34 týdnů 19 % (údaje LWH) je pak odhadovaná úroveň přesnosti dána standardní chybou nebo 3,6 %, což znamená, že míra předčasných porodů by měla být odhadnuta s 95% intervalem spolehlivosti definovaným +-7% stupeň přesnosti. Dále by to mělo vést k přibližně 23 předčasným porodům v rámci observační kohorty, což umožní multivariabilní analýzy včetně 2 kovariát, aby se zjistila síla asociace mezi klinickými/demografickými faktory zájmu oproti předčasnému porodu.

VÝSLEDKOVÁ OPATŘENÍ

Primárním výsledkem bude sPTB <34 týdnů těhotenství. Prediktory vaginální mikroflóry založené na sekvenování genu 16S rRNA budou zahrnovat celkovou vaginální bakteriální zátěž; typ složení vaginální mikrobioty; a vaginální relativní hojnost a odhadované koncentrace L. crispatus, L. iners, všech laktobacilů dohromady, všech BV-anaerobů dohromady a všech patobiontů dohromady. Další prediktory, které jsou měřeny u všech žen, budou zahrnovat koncentraci vaginálních kvasinek Candida, koncentraci FFN a metabolomická data s použitím 20-30 metabolomických prediktorů, které jsou zajímavé na základě výsledků předchozích studií u jednočetných těhotenství od Davida MacIntyrea a kol., Imperial College London. Ve vnořené případové a kontrolní studii budou z metagenomických dat destilovány další prediktory pomocí zavedených bioinformatických potrubí.

Sekundární mateřské a neonatální výsledky budou zaznamenány pro deskriptivní analýzy:

• Výsledky pro matku: PPROM, infekce matky (vyžadující IV antibiotickou léčbu pro podezření na chorioamnionitidu), gestace při porodu (<28 týdnů/<32 týdnů), způsob porodu, léčba PTB.
• Neonatální výsledky: komplikace těhotenství (TTTS/SFGR/TAPS), živý porod, fetální/neonatální úmrtí, porodní hmotnost, neonatální morbidita (IVH/NEC/ROP), přijetí na JIP, závislost na ventilátoru a věk při propuštění z JIP.

STATISTICKÁ METODIKA

Úplná data mikroflóry 16S (všechny bakteriální taxony ve všech vzorcích) budou nejprve vizualizovány v tepelných mapách pro všechny ženy a pro ženy s a bez sPTB. Data pak budou shrnuta pro použití v biostatistických etiologických modelech výpočtem následujícího pro každý jednotlivý vzorek: Odhadované koncentrace L. crispatus, L. iners, všechny laktobacily dohromady, všechny BV-anaeroby dohromady, všechny patobionty dohromady, všechny bakterie dohromady ( z genu 16S qPCR) a všech druhů Candida dohromady (také pomocí qPCR); alfa diverzita (Inverse Simpsonův index); a typy složení mikrobioty pomocí hierarchického shlukování. Tyto proměnné mikrobioty budou testovány jednu po druhé pomocí logistické regrese s výsledkem narození jako závislou proměnnou. Výsledky těchto analýz budou také porovnány s výsledky podobných analýz v našich již existujících vysoce a nízkorizikových předčasných singletonových kohortách (1).

Na souborech dat metagenomu a metabolomu budou provedeny multivariační analýzy bez dohledu a pod dohledem. Následná analýza pomocí analýzy hlavních komponent (PCA) bude použita pro vizualizaci obecných trendů shlukování a klasifikátor Random Forest (RF) bude použit pro skupinové diskriminační analýzy. Rovněž budou provedeny cílené analýzy specifických vlastností metabolitů DESI-MS odvozených od mastných kyselin s krátkým a dlouhým řetězcem a biogenních aminů, u kterých bylo dříve zjištěno, že korelují se složením vaginálního mikrobiomu a stavem imunitní/zánětlivé aktivace (2).