Zavedení komplexní genetické analýzy z jedné buňky

Preimplantační genetická diagnostika (PGD) pro páry s rizikem početí se závažnými genetickými poruchami je pevně zavedena jako platná reprodukční možnost, kterou by páry měly zvážit po vhodném genetickém poradenství. Postup zahrnuje rovnováhu rizik mezi stanovením úspěšného těhotenství a minimalizací rizika chybné diagnózy. PGD ​​poruch jednoho genu se opírá o testy založené na PCR prováděné na jednotlivých buňkách (polárních tělíscích nebo blastomerách). Navzdory používání stále robustnějších protokolů zůstává výpadek alely (ADO; selhání amplifikovat jednu ze dvou alel v heterozygotní buňce) významným problémem pro diagnostiku pomocí jednobuněčné PCR. V extrémních případech může ADO ovlivnit >40 % amplifikace a způsobilo již několik chybných diagnóz PGD.

Základem většiny genetických analýz je dostupnost genomové DNA přiměřené kvality a kvantity. Protože výtěžek DNA z lidských vzorků je často limitující, bylo vynaloženo velké úsilí na vývoj metod pro amplifikaci celého genomu (WGA) pomocí náhodných nebo degenerovaných oligonukleotidů primovaných PCR. Existující metody WGA, jako je degenerovaná PCR s oligonukleotidy, však trpí neúplným pokrytím a neadekvátní průměrnou velikostí DNA. Multiple displacement amplification (MDA) poskytuje vysoce jednotné zastoupení napříč genomem. Amplifikační odchylka mezi osmi chromozomálními lokusy byla méně než 3násobná na rozdíl od 4-6 řádů u metod WGA založených na PCR. Průměrná délka produktu byla >10 kb. MDA je izotermická amplifikace vytěsňující vlákno poskytující přibližně 20-30 μg produktu z pouhých 1-10 kopií lidské genomové DNA. Amplifikace může být provedena přímo z biologických vzorků včetně surové plné krve a buněk tkáňových kultur. MDA-amplifikovaná lidská DNA je užitečná pro několik běžných metod genetické analýzy, včetně genotypizace jednonukleotidových polymorfismů, malování chromozomů, Southern blotting a analýzu polymorfismu délky restrikčních fragmentů, subklonování a sekvenování DNA. WGA založená na MDA je jednoduchá a spolehlivá metoda, která by mohla mít významné důsledky pro genetické studie, forenzní, diagnostiku a dlouhodobé uchovávání vzorků.

V této studii budeme pečlivě měnit reakční podmínky v jednobuněčných amplifikacích z izolovaných periferních lymfocytů, abychom minimalizovali rychlost ADO. Zvážení kauzálních faktorů zjištěných během této studie by mělo umožnit navržení PGD protokolů, které vykazují malou ADO, čímž se zlepší přesnost PGD pro poruchy jednoho genu.