Établissement d'une analyse génétique complète à partir d'une seule cellule

Le diagnostic génétique préimplantatoire (DPI) pour les couples à risque de conceptions présentant des troubles génétiques graves est fermement établi comme une option reproductive valable pour les couples à envisager après un conseil génétique approprié. La procédure implique un équilibre des risques entre l'établissement d'une grossesse réussie et la minimisation du risque d'erreur de diagnostic. Le DPI des troubles monogéniques repose sur des tests basés sur la PCR effectués sur des cellules uniques (corps polaires ou blastomères). Malgré l'utilisation de protocoles de plus en plus robustes, l'abandon d'allèle (ADO ; l'incapacité à amplifier l'un des deux allèles dans une cellule hétérozygote) reste un problème important pour le diagnostic par PCR unicellulaire. Dans les cas extrêmes, l'ADO peut affecter > 40 % des amplifications et a déjà causé plusieurs erreurs de diagnostic de DPI.

La disponibilité d'ADN génomique d'une qualité et d'une quantité adéquates est fondamentale pour la plupart des analyses génétiques. Étant donné que le rendement en ADN des échantillons humains est souvent limité, de nombreux efforts ont été investis dans le développement de méthodes d'amplification du génome entier (WGA) par PCR aléatoire ou dégénérée à base d'oligonucléotides. Cependant, les méthodes WGA existantes telles que la PCR amorcée par oligonucléotide dégénéré souffrent d'une couverture incomplète et d'une taille moyenne d'ADN inadéquate. L'amplification par déplacement multiple (MDA) fournit une représentation hautement uniforme à travers le génome. Le biais d'amplification parmi huit loci chromosomiques était inférieur à 3 fois, contrairement aux ordres de grandeur 4 à 6 pour les méthodes WGA basées sur la PCR. La longueur moyenne des produits était > 10 ko. La MDA est une amplification isotherme à déplacement de brin produisant environ 20 à 30 μg de produit à partir de seulement 1 à 10 copies d'ADN génomique humain. L'amplification peut être effectuée directement à partir d'échantillons biologiques, notamment de sang total brut et de cellules de culture tissulaire. L'ADN humain amplifié par MDA est utile pour plusieurs méthodes courantes d'analyse génétique, notamment le génotypage de polymorphismes nucléotidiques simples, la peinture chromosomique, le transfert de Southern et l'analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction, le sous-clonage et le séquençage de l'ADN. La WGA basée sur le MDA est une méthode simple et fiable qui pourrait avoir des implications importantes pour les études génétiques, la médecine légale, les diagnostics et le stockage d'échantillons à long terme.

Dans cette étude, nous varierons soigneusement les conditions de réaction dans les amplifications unicellulaires à partir de lymphocytes périphériques isolés afin de minimiser le taux d'ADO. La prise en compte des facteurs de causalité identifiés au cours de cette étude devrait permettre la conception de protocoles de DPI qui connaissent peu d'ADO, améliorant ainsi la précision du DPI pour les troubles monogéniques.