Istituzione di un'analisi genetica completa da una singola cellula

La diagnosi genetica preimpianto (PGD) per le coppie a rischio di concepimento con gravi malattie genetiche è fermamente affermata come una valida opzione riproduttiva per le coppie da prendere in considerazione dopo un'appropriata consulenza genetica. La procedura comporta un equilibrio dei rischi tra l'instaurazione di una gravidanza riuscita e la riduzione al minimo del rischio di diagnosi errate. La PGD delle malattie a singolo gene si basa su test basati su PCR eseguiti su singole cellule (corpi polari o blastomeri). Nonostante l'uso di protocolli sempre più robusti, l'allele drop-out (ADO; l'incapacità di amplificare uno dei due alleli in una cellula eterozigote) rimane un problema significativo per la diagnosi mediante PCR a singola cellula. In casi estremi l'ADO può influenzare > 40% delle amplificazioni e ha già causato diverse diagnosi errate della PGD.

Fondamentale per la maggior parte delle analisi genetiche è la disponibilità di DNA genomico di qualità e quantità adeguate. Poiché la resa del DNA da campioni umani è spesso limitante, sono stati investiti molti sforzi nello sviluppo di metodi per l'amplificazione dell'intero genoma (WGA) mediante PCR innescata da oligonucleotidi casuali o degenerati. Tuttavia, i metodi WGA esistenti come la PCR degenerata con oligonucleotidi innescati soffrono di una copertura incompleta e di una dimensione media del DNA inadeguata. L'amplificazione a spostamento multiplo (MDA) fornisce una rappresentazione altamente uniforme in tutto il genoma. Il bias di amplificazione tra otto loci cromosomici era inferiore a 3 volte rispetto a 4-6 ordini di grandezza per i metodi WGA basati su PCR. La lunghezza media del prodotto era >10 kb. L'MDA è un'amplificazione isotermica a spostamento del filamento che produce circa 20-30 μg di prodotto da un minimo di 1-10 copie di DNA genomico umano. L'amplificazione può essere eseguita direttamente da campioni biologici tra cui sangue intero grezzo e cellule di coltura tissutale. Il DNA umano amplificato con MDA è utile per diversi metodi comuni di analisi genetica, tra cui la genotipizzazione di polimorfismi a singolo nucleotide, la pittura cromosomica, il Southern blotting e l'analisi del polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione, il subclonazione e il sequenziamento del DNA. Il WGA basato su MDA è un metodo semplice e affidabile che potrebbe avere implicazioni significative per studi genetici, medicina legale, diagnostica e conservazione di campioni a lungo termine.

In questo studio varieremo attentamente le condizioni di reazione nelle amplificazioni di singole cellule da linfociti periferici isolati per ridurre al minimo il tasso di ADO. La considerazione dei fattori causali identificati durante questo studio dovrebbe consentire la progettazione di protocolli PGD che sperimentano poco ADO, migliorando così l'accuratezza della PGD per i disturbi del singolo gene.