Etablering af omfattende genetisk analyse fra en enkelt celle

Præimplantation genetisk diagnose (PGD) for par med risiko for befrugtninger med alvorlige genetiske lidelser er fast etableret som en gyldig reproduktiv mulighed for par at overveje at følge passende genetisk rådgivning. Proceduren indebærer en afvejning af risici mellem etablering af en vellykket graviditet og minimering af risikoen for fejldiagnosticering. PGD ​​af enkelt-gen-lidelser er afhængig af PCR-baserede tests udført på enkeltceller (polære legemer eller blastomerer). På trods af brugen af ​​stadig mere robuste protokoller er allel-frafald (ADO; manglende amplifikation af en af ​​de to alleler i en heterozygot celle) fortsat et betydeligt problem for diagnosticering ved hjælp af enkeltcellet PCR. I ekstreme tilfælde kan ADO påvirke >40% af amplifikationer og har allerede forårsaget adskillige PGD fejldiagnoser.

Grundlæggende for de fleste genetiske analyser er tilgængeligheden af ​​genomisk DNA af passende kvalitet og kvantitet. Fordi DNA-udbyttet fra humane prøver ofte er begrænsende, er der blevet investeret meget i at udvikle metoder til helgenom-amplifikation (WGA) ved tilfældig eller degenereret oligonukleotid-primet PCR. Imidlertid lider eksisterende WGA-metoder såsom degenereret oligonukleotidprimeret PCR af ufuldstændig dækning og utilstrækkelig gennemsnitlig DNA-størrelse. Multiple displacement amplification (MDA) giver en meget ensartet repræsentation på tværs af genomet. Amplifikationsbias blandt otte kromosomale loci var mindre end 3 gange i modsætning til 4-6 størrelsesordener for PCR-baserede WGA-metoder. Gennemsnitlig produktlængde var >10 kb. MDA er en isotermisk, streng-fortrængende amplifikation, der giver omkring 20-30 μg produkt fra så få som 1-10 kopier af humant genomisk DNA. Amplifikation kan udføres direkte fra biologiske prøver, herunder rå helblod og vævskulturceller. MDA-amplificeret humant DNA er nyttigt til flere almindelige metoder til genetisk analyse, herunder genotypning af enkeltnukleotidpolymorfismer, kromosommaling, Southern blotting og restriktionsfragmentlængdepolymorfianalyse, subkloning og DNA-sekventering. MDA-baseret WGA er en enkel og pålidelig metode, der kan have betydelige konsekvenser for genetiske undersøgelser, retsmedicin, diagnostik og langsigtet prøveopbevaring.

I denne undersøgelse vil vi omhyggeligt variere reaktionsbetingelserne i enkeltcelleamplifikationer fra isolerede perifere lymfocytter for at minimere hastigheden af ​​ADO. Overvejelse af de årsagsfaktorer, der er identificeret i løbet af denne undersøgelse, bør tillade design af PGD-protokoller, der oplever lidt ADO, og dermed forbedre nøjagtigheden af ​​PGD for enkelt gen-lidelser.