単一細胞からの包括的な遺伝子解析の確立

重篤な遺伝性疾患を有する受胎のリスクがあるカップルのための着床前遺伝子診断 (PGD) は、適切な遺伝カウンセリングに従ってカップルが考慮すべき有効な生殖オプションとして確立されています。 この処置には、妊娠の成功と誤診のリスクの最小化との間のリスクのバランスが伴います。 単一遺伝子疾患の PGD は、単一細胞 (極体または割球) で実行される PCR ベースのテストに依存しています。 ますます堅牢なプロトコルの使用にもかかわらず、対立遺伝子ドロップアウト (ADO; ヘテロ接合細胞内の 2 つの対立遺伝子の 1 つを増幅できないこと) は、シングルセル PCR を使用した診断にとって依然として重大な問題です。 極端な場合、ADO は増幅の 40% を超える影響を与える可能性があり、すでにいくつかの PGD 誤診を引き起こしています。

ほとんどの遺伝子解析の基本は、適切な質と量のゲノム DNA を利用できることです。 ヒトサンプルからの DNA 収量はしばしば制限されるため、ランダムまたは変性オリゴヌクレオチドプライミング PCR による全ゲノム増幅 (WGA) の方法の開発に多くの努力が注がれてきました。 しかし、縮退オリゴヌクレオチドを用いた PCR のような既存の WGA 法は、不完全なカバレッジと不適切な平均 DNA サイズに悩まされています。 多重変位増幅 (MDA) は、ゲノム全体で非常に均一な表現を提供します。 8 つの染色体遺伝子座間の増幅バイアスは、PCR ベースの WGA メソッドの 4 ～ 6 桁とは対照的に、3 倍未満でした。 平均生成物長は 10 kb を超えていました。 MDA は、1 ～ 10 コピーのヒトゲノム DNA から約 20 ～ 30 μg の生成物を生成する、等温鎖置換増幅です。 増幅は、粗全血や組織培養細胞などの生物学的サンプルから直接行うことができます。 MDA 増幅ヒト DNA は、一塩基多型のジェノタイピング、染色体ペインティング、サザンブロッティングおよび制限断片長多型解析、サブクローニング、DNA 配列決定など、いくつかの一般的な遺伝子解析方法に役立ちます。 MDA ベースの WGA は、遺伝子研究、法医学、診断、およびサンプルの長期保存に重要な意味を持つシンプルで信頼性の高い方法です。

この研究では、単離された末梢リンパ球からの単一細胞増幅における反応条件を慎重に変化させて、ADO の割合を最小限に抑えます。 この研究中に特定された因果要因を考慮することで、ADOをほとんど経験しないPGDプロトコルの設計が可能になり、単一遺伝子障害のPGDの精度が向上するはずです。