Etablierung einer umfassenden genetischen Analyse aus einer einzelnen Zelle

Die genetische Präimplantationsdiagnostik (PID) für Paare mit Risiko für eine Empfängnis mit schweren genetischen Störungen ist fest etabliert als gültige reproduktive Option, die Paare nach einer angemessenen genetischen Beratung in Betracht ziehen sollten. Das Verfahren beinhaltet ein Gleichgewicht der Risiken zwischen der Etablierung einer erfolgreichen Schwangerschaft und der Minimierung des Risikos einer Fehldiagnose. Die PID von Einzelgenerkrankungen beruht auf PCR-basierten Tests, die an einzelnen Zellen (Polkörperchen oder Blastomeren) durchgeführt werden. Trotz der Verwendung immer robusterer Protokolle bleibt Allel-Drop-out (ADO; das Versäumnis, eines der beiden Allele in einer heterozygoten Zelle zu amplifizieren) ein erhebliches Problem für die Diagnose mit Einzelzell-PCR. ADO kann im Extremfall >40% der Amplifikationen beeinflussen und hat bereits zu mehreren PID-Fehldiagnosen geführt.

Grundlegend für die meisten genetischen Analysen ist die Verfügbarkeit von genomischer DNA in angemessener Qualität und Quantität. Da die DNA-Ausbeute aus menschlichen Proben häufig begrenzt ist, wurde viel Aufwand in die Entwicklung von Verfahren zur Amplifikation des gesamten Genoms (WGA) durch zufällige oder degenerierte Oligonukleotid-geprimte PCR investiert. Bestehende WGA-Methoden wie degenerierte Oligonukleotid-geprimte PCR leiden jedoch unter unvollständiger Abdeckung und unzureichender durchschnittlicher DNA-Größe. Multiple Displacement Amplification (MDA) bietet eine sehr einheitliche Darstellung über das Genom. Die Amplifikationsabweichung zwischen acht chromosomalen Loci war weniger als 3-fach im Gegensatz zu 4–6 Größenordnungen bei PCR-basierten WGA-Verfahren. Die durchschnittliche Produktlänge betrug >10 kb. MDA ist eine isotherme, strangverdrängende Amplifikation, die etwa 20–30 μg Produkt aus nur 1–10 Kopien menschlicher genomischer DNA ergibt. Die Amplifikation kann direkt aus biologischen Proben durchgeführt werden, einschließlich rohem Vollblut und Gewebekulturzellen. MDA-amplifizierte menschliche DNA ist für mehrere gängige Methoden der genetischen Analyse nützlich, einschließlich der Genotypisierung von Einzelnukleotidpolymorphismen, Chromosomenmalerei, Southern-Blotting und Restriktionsfragment-Längenpolymorphismusanalyse, Subklonierung und DNA-Sequenzierung. MDA-basierte WGA ist eine einfache und zuverlässige Methode, die erhebliche Auswirkungen auf genetische Studien, Forensik, Diagnostik und langfristige Probenlagerung haben könnte.

In dieser Studie werden wir die Reaktionsbedingungen in Einzelzellamplifikationen von isolierten peripheren Lymphozyten sorgfältig variieren, um die ADO-Rate zu minimieren. Die Berücksichtigung der kausalen Faktoren, die während dieser Studie identifiziert wurden, sollte die Gestaltung von PID-Protokollen ermöglichen, die wenig ADO erfahren, wodurch die Genauigkeit der PID für Störungen einzelner Gene verbessert wird.