Создание комплексного генетического анализа из одной клетки

Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) для пар, подверженных риску зачатия с серьезными генетическими нарушениями, прочно зарекомендовала себя как действительный репродуктивный вариант, который пары должны рассмотреть после соответствующей генетической консультации. Процедура влечет за собой баланс рисков между установлением успешной беременности и минимизацией риска ошибочного диагноза. ПГД нарушений одного гена основывается на тестах на основе ПЦР, проводимых на отдельных клетках (полярных тельцах или бластомерах). Несмотря на использование все более надежных протоколов, выпадение аллеля (ADO; неспособность амплифицировать один из двух аллелей в гетерозиготной клетке) остается серьезной проблемой для диагностики с использованием ПЦР одной клетки. В крайних случаях ADO может повлиять на> 40% амплификации и уже вызвал несколько ошибочных диагнозов PGD.

Основой большинства генетических анализов является наличие геномной ДНК надлежащего качества и количества. Поскольку выход ДНК из образцов человека часто ограничен, много усилий было вложено в разработку методов амплификации всего генома (WGA) с помощью случайной или вырожденной ПЦР с примированием олигонуклеотидов. Однако существующие методы WGA, такие как ПЦР с вырожденными олигонуклеотидами, страдают неполным охватом и неадекватным средним размером ДНК. Амплификация с множественным смещением (MDA) обеспечивает очень однородное представление по всему геному. Смещение амплификации среди восьми хромосомных локусов было менее чем в 3 раза меньше, чем в 4-6 порядков для методов WGA на основе ПЦР. Средняя длина продукта составляла >10 кб. MDA представляет собой изотермическую амплификацию со смещением цепи, дающую около 20-30 мкг продукта всего из 1-10 копий геномной ДНК человека. Амплификацию можно проводить непосредственно из биологических образцов, включая неочищенную цельную кровь и клетки тканевых культур. MDA-амплифицированная ДНК человека используется для нескольких распространенных методов генетического анализа, включая генотипирование однонуклеотидных полиморфизмов, окрашивание хромосом, Саузерн-блоттинг и анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, субклонирование и секвенирование ДНК. WGA на основе MDA — это простой и надежный метод, который может иметь большое значение для генетических исследований, криминалистики, диагностики и длительного хранения образцов.

В этом исследовании мы будем тщательно варьировать условия реакции при амплификации отдельных клеток из изолированных периферических лимфоцитов, чтобы свести к минимуму скорость ADO. Рассмотрение причинных факторов, выявленных в ходе этого исследования, должно позволить разработать протоколы ПГД, в которых мало случаев ADO, что повысит точность ПГД при заболеваниях одного гена.