Detekce genetických markerů rakoviny plic

Vícestupňová teorie karcinogeneze zahrnuje vývoj mnohočetných aktivačních genetických změn v důsledku expozice karcinogenům, buď primárně, nebo superponovaných na již existující mutace v genomu. Tyto změny mají za následek aktivaci protoonkogenů, nedostatek exprese tumor supresorových genů nebo kombinace výše uvedených, jejichž součet vede k maligní transformaci. Podrobné analýzy chromozomálních lézí u bronchogenního karcinomu plic odhalují několik opakujících se abnormalit, včetně delecí, duplikací nebo polysomií chromozomů 1, 3, 7 a 20. Aberace v krátkém raménku chromozomu 3, zejména, se nacházejí u mnoha malobuněčných a nemalobuněčných karcinomů plic a polysomie 7 je častým nálezem u nemalobuněčných karcinomů plic. Mnoho z těchto abnormalit nemá žádný identifikovaný význam, nicméně aplikace současných a vyvíjejících se technik molekulární biologie odhalila specifické genomové změny vedoucí k maligním fenotypům u několika nádorů, například aplikace amplifikačních technik polymerázové řetězové reakce odhalila nápadný výskyt byly objeveny mutace v protoonkogenech h- a k-ras, spojené s nadměrnou expresí růstových faktorů nebo receptorů, například receptoru epidermálního růstového faktoru.

Protože všechny epiteliální buňky jsou vystaveny podobným podmínkám prostředí, zdá se pravděpodobné, že mnoho buněk podléhá mutagenezi současně. Klinicky je to často zřejmé, protože u 10-20 % pacientů s rakovinou plic se objeví další epiteliální rakovina, buď souběžně, nebo později v průběhu. Predispozice ke vzniku druhých malignit postihuje i další povrchy epitelu, např. u pacientů s rakovinou hlavy a krku je silná tendence k rozvoji druhé malignity (bronchogenní karcinom plic) v aerodigestivním traktu. Navzdory celkovému poklesu míry kouření ve Spojených státech projekce do roku 2025 naznačují, že stále bude ročně 100 000 úmrtí na rakovinu plic a další rakoviny související s kouřením. Proto by bylo velkým přínosem pro pacienty s rizikem rozvoje karcinomu plic identifikovat tyto změny ještě před rozvojem invazivních maligních lézí. To platí zejména pro pacienty, u kterých se již rakovina vyvinula, nebo pro pacienty se silnou rodinnou anamnézou, kteří mohou být vystaveni karcinogenům v zaměstnání (např. azbest) nebo v obvyklém (např. cigaretový kouř). Identifikace zhoubných nádorů v preklinickém stadiu se již dříve zkoušela, například pomocí screeningových rentgenových snímků hrudníku nebo cytologií sputa, avšak tyto přístupy se neukázaly jako přínosné, protože současné detekční metody nejsou dostatečně citlivé na to, aby včas identifikovaly, - fenotypové změny. Zde nastíněný návrh je navržen tak, aby objasnil tento problém vyšetřením bronchiální tkáně pacientů s rizikem rozvoje druhého karcinomu (pacienti podstupující primární resekci za účelem vyléčení bronchogenního karcinomu plic) a posouzením bioptické tkáně na přítomnost chromozomálních abnormalit a mutací v protoonkogeny h- a k-ras. Tyto změny mohou být přítomny po dlouhou dobu v epiteliálních buňkách dýchacích cest před rozvojem zjevných patologických změn a metody k rozpoznání těchto změn by byly užitečné pro posouzení a sledování pacientů s rizikem rozvoje malignity.

Význam stavu lymfatických uzlin u karcinomu plic: U pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic (NSCLC) je stadium tumoru nejsilnější determinantou prognózy. Stratifikace pacientů do stadií usnadňuje individuální rozhodnutí o léčbě na základě statistik přežití populace. V rámci těchto stadiovaných populací však podskupiny pacientů se zjevným časným onemocněním budou stále trpět recidivou rakoviny. To je způsobeno neschopností současných metod stagingu detekovat malé množství diseminovaných nádorových buněk (mikrometastáz) u těchto pacientů. Bylo ukázáno, že reverzní transkripční-PCR (RT-PCR) pro mediátorovou RNA související s rakovinou detekuje přítomnost mikrometastáz v histologicky negativních vzorcích lymfatických uzlin a tyto nálezy korelují se špatným výsledkem. Rutinní klinická aplikace této techniky byla bohužel omezena „falešně pozitivními“ výsledky v kontrolních tkáních a nízkou specificitou pro predikci recidivy onemocnění. Nedávno jsme ukázali, že kvantitativní RT-PCR (QRT-PCR) může rozlišovat mezi pravdivými a falešnými pozitivními výsledky a že to vede ke zlepšené schopnosti předpovídat recidivu. V tomto návrhu máme v úmyslu analyzovat lymfatické uzliny pacientů podstupujících chirurgickou resekci pro NSCLC pomocí kvantitativní RT-PCR. Tito pacienti budou poté sledováni po dobu pěti let, aby se určila recidiva nádoru. Cílem je pomocí QRT-PCR pokusit se identifikovat, u kterých pacientů je nejvyšší riziko recidivy onemocnění, a kteří proto mohou mít prospěch z agresivnějších terapií.

Specifické cíle

1. Získat a udržet v buněčné kultuře „normální“ bronchiální epiteliální buňky (NBEC) a nádory od pacientů podstupujících resekci pro léčbu karcinomu plic a mezoteliomu.
2. Odebírat NBEC a nádory plic pro hodnocení genetických abnormalit.
3. Provádět molekulární analýzu včetně amplifikace polymerázové řetězové reakce (PCR), průtokové cytometrie, imunohistochemie a genové analýzy materiálu z NBEC, nádorů, přilehlých a normálních plic a krve pro hodnocení, jako jsou mutace v protoonkogenech K-ras a p53. jako další kandidátní geny a dráhy, jako jsou ty, které se účastní epiteliálně-mezenchymálního přechodu. Kromě toho budeme hledat mutace a změny exprese Fas, Fas ligandu a FADD, tří molekul, které zprostředkovávají programovanou buněčnou smrt a nedávno se ukázalo, že jsou exprimovány na mnoha nádorových buňkách včetně rakoviny plic.
4. Analyzovat cytokiny přítomné v lavážní tekutině, nádorech a plicních tkáních.
5. Produkovat kultury T buněk z buněk přítomných v lymfatických uzlinách odvodňujících nádor a v nádorové tkáni. Izolovat, numericky rozšířit a také fenotypově a funkčně charakterizovat lidské lymfocyty infiltrující nádory (TIL) a nádorové buňky pro potenciální rozvoj budoucích klinických studií buněčné terapie.
6. Analyzovat intrapulmonální a mediastinální lymfatické uzliny na expresi mRNA souvisejících s nádorem (jako je karcinoembryonální antigen (CEA), cytokeratin-19, hepatocytární růstový faktor, receptor pro peptid uvolňující gastrin (GRP) a receptor neuromedinu-B (NMB) ) jako potenciální důkaz mikrometastáz.
7. K detekci metastatického nádoru v kostní dřeni extrahované z vyřazeného materiálu resekce žeber.
8. Analyzovat biomarkery a cirkulující nádorovou DNA (ctDNA) v biologických vzorcích a korelovat se zobrazovací analýzou a výsledky.
9. Provádět genomické, proteomické, metabolomické, mikrobiomické a imunologické výzkumné studie na odebraných vzorcích.

Význam

Několik výzkumníků již zjistilo, že chromozomální změny se u nemalobuněčného karcinomu plic vyskytují v nenáhodném vzoru. Zdá se, že tyto změny korelují se specifickými genetickými změnami, což vede k malignímu fenotypu. Kromě toho velké množství experimentálních důkazů podporuje vícestupňovou teorii karcinogeneze, kdy se hromadí postupné změny v genomu, což vede k malignímu fenotypu. Konečný produkt akumulovaných změn je určen buňkou původu a počtem a závažností změn, ke kterým dochází. Doufáme, že prokážeme, že lze identifikovat časné změny (vyjádřené karyotypovými změnami nebo konkrétními bodovými mutacemi), které by naznačovaly pravděpodobnost, že se u konkrétního pacienta vyvine další malignita. Tyto informace by pak mohly být aplikovány na klinické situace, například ke stanovení frekvence klinického sledování pomocí rentgenu hrudníku, screeningové bronchoskopie nebo cytologie sputa. Kromě toho by shromážděné informace mohly pomoci identifikovat jednu nebo několik genetických změn nezbytných pro transformaci, které by pak mohly být prozkoumány a dále definovat proces transformace.

Přítomnost maligních buněk v lymfatických uzlinách je kritickým parametrem při stagingu pacientů s rakovinou plic. Hodnocení lymfatických uzlin se v současné době provádí pouze histopatologií. Dlouhodobé přežití pacientů s rakovinou plic, kteří mají onemocnění ve stadiu IB (žádné známé postižení lymfatických uzlin s nádorem větším než 2 cm) je nižší než u pacientů ve stadiu IA (žádné známé postižení lymfatických uzlin s nádorem menším než 2 cm) . Podobně míra přežití pacientů, kteří jsou posouzeni jako stádium II na základě histologicky pozitivních lymfatických uzlin první úrovně, často není lepší než přežití pacientů ve vyšším stádiu, kteří mají postižení lymfatických uzlin druhé úrovně. Tato pozorování naznačují, že mikrometastázy jsou často přítomny v lymfatických uzlinách, které nejsou detekovatelné histologickým vyšetřením. Tento návrh doplní histopatologické vyšetření lymfatických uzlin o metody, které detekují okultní metastatické buňky, aby se zjistilo, zda zařazení pacientů do vyššího stadia přesněji odráží jejich chorobnou zátěž. To by mohlo ovlivnit následnou léčbu a výsledky pacienta.