Detecção de Marcadores Genéticos de Câncer de Pulmão

A teoria de múltiplos estágios da carcinogênese inclui o desenvolvimento de múltiplas alterações genéticas ativadoras devido à exposição a carcinógenos, primariamente ou sobrepostos a mutações pré-existentes no genoma. Essas alterações resultam na ativação de protooncogenes, falta de expressão de genes supressores de tumor ou combinações dos anteriores, cuja soma resulta em transformação maligna. Análises detalhadas de lesões cromossômicas no câncer broncogênico de pulmão revelam várias anormalidades recorrentes, incluindo deleções, duplicações ou polissomia dos cromossomos 1, 3, 7 e 20. Aberrações no braço curto do cromossomo 3, em particular, são encontradas em muitos cânceres de pulmão de células pequenas e não pequenas, e a polissomia 7 é um achado frequente em cânceres de pulmão de células não pequenas. Muitas dessas anormalidades não têm significado identificado, no entanto, a aplicação de técnicas atuais e em evolução da biologia molecular revelou alterações genômicas específicas que levam a fenótipos malignos em vários tumores, por exemplo, a aplicação de técnicas de amplificação da reação em cadeia da polimerase revelou uma incidência impressionante de mutações nos proto-oncogenes h- e k-ras foram descobertas, associadas à superexpressão de fatores de crescimento ou receptores, por exemplo, receptor do fator de crescimento epidérmico.

Como todas as células epiteliais são expostas a condições ambientais semelhantes, parece provável que muitas células sofram mutagênese simultaneamente. Clinicamente, isso é freqüentemente aparente, já que 10-20% dos pacientes com câncer de pulmão apresentam outro câncer epitelial, concomitantemente ou em algum momento posterior de seu curso. A predisposição para o desenvolvimento de segundas malignidades também afeta outras superfícies epiteliais, por exemplo, há uma forte tendência de pacientes com câncer de cabeça e pescoço desenvolverem uma segunda malignidade (câncer broncogênico de pulmão) no trato aerodigestivo. Apesar das reduções na taxa geral de tabagismo nos Estados Unidos, as projeções até 2025 indicam que ainda haverá 100.000 mortes anualmente por câncer de pulmão e outros cânceres associados ao tabagismo. Portanto, seria de grande benefício para pacientes com risco de desenvolver câncer de pulmão identificar essas alterações antes do desenvolvimento de lesões malignas invasivas. Isso é particularmente verdadeiro em pacientes que já desenvolveram um câncer ou em pacientes com forte histórico familiar que podem ter exposição ocupacional (por exemplo, amianto) ou habitual (por exemplo, fumaça de cigarro) a carcinógenos. A identificação de cânceres no estágio pré-clínico foi tentada anteriormente, por exemplo, com radiografias de tórax ou citologias de escarro, no entanto, essas abordagens não provaram ser benéficas, pois os métodos de detecção atuais não são sensíveis o suficiente para identificar precocemente, não -alterações fenotípicas. A proposta aqui delineada visa esclarecer essa questão, examinando o tecido brônquico de pacientes com risco de desenvolver um segundo câncer (pacientes submetidos à ressecção primária para cura do câncer pulmonar broncogênico) e avaliando o tecido da biópsia quanto à presença de anormalidades cromossômicas e mutações em os protooncogenes h e k-ras. Essas alterações podem estar presentes por longos períodos de tempo nas células epiteliais das vias aéreas antes do desenvolvimento de alterações patológicas evidentes, e os métodos para reconhecer essas alterações seriam úteis para avaliar e acompanhar os pacientes com risco de desenvolver malignidade.

Importância do status dos linfonodos no câncer de pulmão: em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (CPNPC), o estágio do tumor é o determinante mais forte do prognóstico. A estratificação dos pacientes em estágios facilita as decisões individuais de tratamento com base nas estatísticas de sobrevivência de uma população. No entanto, dentro dessas populações em estágios, subconjuntos de pacientes com doença aparentemente precoce ainda sofrerão recorrência do câncer. Isso se deve à incapacidade dos métodos de estadiamento atuais em detectar um pequeno número de células tumorais disseminadas (micrometástases) nesses pacientes. A transcrição reversa-PCR (RT-PCR) para RNA mensageiro relacionado ao câncer demonstrou detectar a presença de micrometástases em espécimes de linfonodos histologicamente negativos, e esses achados se correlacionam com resultados ruins. Infelizmente, a aplicação clínica de rotina desta técnica tem sido limitada por resultados "falsos positivos" em tecidos de controle e uma baixa especificidade para prever a recorrência da doença. Recentemente, mostramos que o RT-PCR quantitativo (QRT-PCR) pode discriminar entre verdadeiros e falsos positivos e que isso resulta em uma capacidade aprimorada de prever a recorrência. Nesta proposta pretendemos analisar linfonodos de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica de NSCLC utilizando RT-PCR quantitativo. Esses pacientes serão acompanhados por cinco anos para determinar a recorrência do tumor. O objetivo é usar o QRT-PCR para tentar identificar quais pacientes têm maior risco de recorrência da doença e quem, portanto, pode se beneficiar de terapias mais agressivas.

Objetivos Específicos

1. Obter e manter em cultura celular células epiteliais brônquicas (NBECs) 'normais' e tumores de pacientes submetidos à ressecção para tratamento de carcinoma pulmonar e mesotelioma.
2. Para colher NBEC e tumores pulmonares para avaliação de anormalidades genéticas.
3. Para realizar análises moleculares, incluindo amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR), citometria de fluxo, imuno-histoquímica e análise genética de material de NBECs, tumores, pulmão adjacente e normal e sangue para avaliação, como mutações nos proto-oncogenes K-ras e p53, bem assim como outros genes candidatos e vias como as envolvidas na transição epitelial-mesenquimal. Além disso, procuraremos mutações e alterações de expressão de Fas, Fas ligando e FADD, três moléculas que medeiam a morte celular programada e recentemente demonstraram ser expressas em múltiplas células tumorais, incluindo câncer de pulmão.
4. Analisar as citocinas presentes no fluido de lavagem, tumores e tecidos pulmonares.
5. Para produzir culturas de células T a partir de células presentes em gânglios linfáticos de drenagem tumoral e em tecido tumoral. Isolar, expandir numericamente, bem como caracterizar fenotipicamente e funcionalmente linfócitos humanos infiltrantes de tumor (TILs) e células tumorais para o potencial desenvolvimento de futuros estudos clínicos de terapia celular.
6. Analisar linfonodos intrapulmonares e mediastinais para expressão de mRNAs relacionados ao tumor (como antígeno carcinoembrionário (CEA), citoqueratina-19, fator de crescimento de hepatócitos, receptor de peptídeo liberador de gastrina (GRP) e receptor de neuromedina-B (NMB) ) como evidência potencial de micrometástases.
7. Detectar tumor metastático na medula óssea extraída de material de ressecção de costela descartado.
8. Analisar biomarcadores e DNA tumoral circulante (ctDNA) em amostras biológicas e correlacionar com análise de imagem e resultados.
9. Conduzir estudos de pesquisa genômica, proteômica, metabolômica, microbiomática e imunológica em amostras coletadas.

Significado

Vários pesquisadores já estabeleceram que as alterações cromossômicas ocorrem em um padrão não aleatório no câncer de pulmão de células não pequenas. Parece que essas alterações se correlacionam com alterações genéticas específicas, resultando no fenótipo maligno. Além disso, uma grande quantidade de evidências experimentais apóia a teoria de múltiplos estágios da carcinogênese, segundo a qual mudanças incrementais no genoma se acumulam, resultando no fenótipo maligno. O produto final das alterações acumuladas é determinado pela célula de origem e pelo número e gravidade das alterações que ocorrem. Esperamos estabelecer que alterações precoces (expressas por alterações cariotípicas ou por mutações pontuais específicas) podem ser identificadas, o que indicaria a probabilidade de um determinado paciente desenvolver outra malignidade. Essas informações poderiam então ser aplicadas a situações clínicas, por exemplo, para determinar a frequência do acompanhamento clínico por radiografia de tórax, broncoscopia de rastreamento ou citologia de escarro. Além disso, as informações coletadas podem ajudar a identificar uma ou algumas mudanças genéticas necessárias para a transformação, que podem ser exploradas para definir melhor o processo de transformação.

A presença de células malignas nos linfonodos é um parâmetro crítico no estadiamento de pacientes com câncer de pulmão. A avaliação dos gânglios linfáticos é atualmente feita apenas por histopatologia. A sobrevida a longo prazo de pacientes com câncer de pulmão com doença em estágio IB (sem envolvimento conhecido de linfonodos com tumor maior que 2 cm) é menor do que pacientes com estágio IA (sem envolvimento conhecido de linfonodos com tumor menor que 2 cm) . Da mesma forma, as taxas de sobrevivência de pacientes que são considerados estágio II com base em linfonodos histologicamente positivos de nível um geralmente não são melhores do que as de pacientes de estágio superior que têm envolvimento de linfonodos de nível dois. Essas observações sugerem que as micrometástases estão frequentemente presentes em linfonodos que não são detectáveis ​​por avaliação histológica. Esta proposta complementará o exame histopatológico dos gânglios linfáticos com métodos que detectam células metastáticas ocultas para determinar se a atribuição de pacientes a um estágio superior reflete com mais precisão a carga da doença. Isso pode afetar o tratamento subsequente e os resultados do paciente.