Wykrywanie markerów genetycznych raka płuc

Wieloetapowa teoria karcynogenezy obejmuje rozwój wielu aktywujących zmian genetycznych w wyniku narażenia na czynniki rakotwórcze, albo pierwotnie, albo nałożone na wcześniej istniejące mutacje w genomie. Zmiany te skutkują aktywacją protoonkogenów, brakiem ekspresji genów supresorowych nowotworów lub kombinacją powyższych, których suma skutkuje transformacją złośliwą. Szczegółowe analizy zmian chromosomalnych w bronchogennym raku płuca ujawniają kilka powtarzających się nieprawidłowości, w tym delecje, duplikacje lub polisomię chromosomów 1, 3, 7 i 20. W szczególności aberracje w krótkim ramieniu chromosomu 3 stwierdza się w wielu drobnokomórkowych i niedrobnokomórkowych rakach płuc, a polisomia 7 jest częstym objawem w niedrobnokomórkowych rakach płuc. Wiele z tych nieprawidłowości nie ma określonego znaczenia, jednak zastosowanie obecnych i rozwijających się technik biologii molekularnej ujawniło specyficzne zmiany genomowe prowadzące do fenotypów złośliwych w kilku nowotworach, na przykład zastosowanie technik amplifikacji reakcji łańcuchowej polimerazy ujawniło uderzającą częstość występowania odkryto mutacje w protoonkogenach h- i k-ras, związane z nadekspresją czynników wzrostu lub receptorów, np. receptora naskórkowego czynnika wzrostu.

Ponieważ wszystkie komórki nabłonkowe są wystawione na podobne warunki środowiskowe, wydaje się prawdopodobne, że wiele komórek przechodzi jednocześnie mutagenezę. Klinicznie jest to często widoczne, ponieważ u 10-20% pacjentów z rakiem płuc pojawia się inny rak nabłonkowy, jednocześnie lub w późniejszym czasie. Predyspozycje do rozwoju wtórnych nowotworów dotyczą również innych powierzchni nabłonka, np. u pacjentów z rakiem głowy i szyi istnieje silna tendencja do rozwoju drugiego nowotworu (rak oskrzeli) w przewodzie pokarmowym. Pomimo spadku ogólnego wskaźnika palenia w Stanach Zjednoczonych, prognozy do 2025 roku wskazują, że nadal będzie 100 000 zgonów rocznie z powodu raka płuc i innych nowotworów związanych z paleniem. W związku z tym byłoby bardzo korzystne dla pacjentów zagrożonych rozwojem raka płuca, aby zidentyfikować te zmiany przed rozwojem inwazyjnych zmian złośliwych. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku pacjentów, u których rozwinął się już rak lub pacjentów z silnym wywiadem rodzinnym, którzy mogą mieć zawodową (np. azbest) lub nawykową (np. dym papierosowy) ekspozycję na czynniki rakotwórcze. Identyfikację nowotworów na etapie przedklinicznym podejmowano już wcześniej, na przykład za pomocą prześwietleń klatki piersiowej lub cytologii plwociny, jednak metody te nie okazały się korzystne, ponieważ obecne metody wykrywania nie są wystarczająco czułe, aby wykryć wczesne, niezwiązane -zmiany fenotypowe. Przedstawiona tu propozycja ma na celu wyjaśnienie tej kwestii poprzez badanie tkanki oskrzeli od pacjentów zagrożonych rozwojem drugiego nowotworu (pacjenci poddawani pierwotnej resekcji w celu wyleczenia bronchogennego raka płuca) oraz ocenę tkanki pobranej z biopsji pod kątem obecności nieprawidłowości chromosomalnych i mutacji w protoonkogeny h- i k-ras. Zmiany te mogą być obecne przez długi czas w komórkach nabłonka dróg oddechowych przed rozwojem jawnych zmian patologicznych, a metody rozpoznawania tych zmian byłyby przydatne do oceny i obserwacji pacjentów z ryzykiem rozwoju nowotworu złośliwego.

Znaczenie stanu węzłów chłonnych w raku płuca: U pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) stopień zaawansowania nowotworu jest najsilniejszym wyznacznikiem rokowania. Podział pacjentów na etapy ułatwia podejmowanie decyzji dotyczących indywidualnego leczenia w oparciu o statystyki przeżycia populacji. Jednak w ramach tych podzielonych na etapy populacji podgrupy pacjentów z pozorną wczesną chorobą nadal będą cierpieć z powodu nawrotu raka. Wynika to z niezdolności obecnych metod oceny stopnia zaawansowania do wykrycia niewielkiej liczby rozsianych komórek nowotworowych (mikroprzerzutów) u tych pacjentów. Wykazano, że metoda PCR z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) dla informacyjnego RNA związanego z rakiem wykrywa obecność mikroprzerzutów w histologicznie negatywnych próbkach węzłów chłonnych, a wyniki te korelują ze złym wynikiem. Niestety, rutynowe kliniczne zastosowanie tej techniki było ograniczone przez „fałszywie dodatnie” wyniki w tkankach kontrolnych i niską specyficzność w przewidywaniu nawrotu choroby. Niedawno wykazaliśmy, że ilościowa RT-PCR (QRT-PCR) może rozróżnić wyniki prawdziwie i fałszywie dodatnie, co skutkuje lepszą zdolnością przewidywania nawrotów. W tej propozycji zamierzamy analizować węzły chłonne od pacjentów poddawanych resekcji chirurgicznej z powodu NSCLC przy użyciu ilościowej RT-PCR. Pacjenci ci będą następnie obserwowani przez pięć lat w celu określenia nawrotu guza. Celem jest wykorzystanie QRT-PCR do próby określenia, którzy pacjenci są najbardziej narażeni na nawrót choroby i którzy w związku z tym mogą skorzystać na bardziej agresywnych terapiach.

Konkretne cele

1. Uzyskanie i utrzymanie w hodowli komórkowej „normalnych” komórek nabłonka oskrzeli (NBEC) i guzów od pacjentów poddawanych resekcji w celu leczenia raka płuc i międzybłoniaka.
2. Aby pobrać NBEC i guzy płuc do oceny nieprawidłowości genetycznych.
3. Przeprowadzanie analiz molekularnych, w tym amplifikacji reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), cytometrii przepływowej, immunohistochemii i analizy genów materiału z NBEC, guzów, sąsiednich i prawidłowych płuc oraz krwi w celu oceny, takiej jak mutacje w protoonkogenach K-ras i p53, a także jak inne potencjalne geny i szlaki, takie jak te zaangażowane w przejście nabłonkowo-mezenchymalne. Ponadto będziemy szukać mutacji i zmian ekspresji Fas, ligandu Fas i FADD, trzech cząsteczek, które pośredniczą w zaprogramowanej śmierci komórki i ostatnio wykazano, że ulegają ekspresji na wielu komórkach nowotworowych, w tym na raku płuc.
4. Analiza cytokin obecnych w popłuczynach, guzach i tkankach płuc.
5. Do produkcji hodowli komórek T z komórek obecnych w węzłach chłonnych drenujących guz iw tkance nowotworowej. Aby wyizolować, rozszerzyć numerycznie, a także scharakteryzować fenotypowo i funkcjonalnie ludzkie limfocyty naciekające nowotwór (TIL) i komórki nowotworowe na potrzeby potencjalnego rozwoju przyszłych badań klinicznych nad terapią komórkową.
6. Analiza śródpłucnych i śródpiersiowych węzłów chłonnych pod kątem ekspresji mRNA związanych z nowotworem (takich jak antygen rakowo-płodowy (CEA), cytokeratyna-19, czynnik wzrostu hepatocytów, receptor peptydu uwalniającego gastrynę (GRP) i receptor neuromedyny B (NMB) ) jako potencjalny dowód mikroprzerzutów.
7. W celu wykrycia guza przerzutowego w szpiku kostnym wyekstrahowanym z odrzuconego materiału z resekcji żeber.
8. Analiza biomarkerów i krążącego DNA guza (ctDNA) w próbkach biologicznych oraz korelacja z analizą obrazową i wynikami.
9. Przeprowadzanie badań genomicznych, proteomicznych, metabolomicznych, mikrobiomowych i immunologicznych na pobranych próbkach.

Znaczenie

Kilku badaczy ustaliło już, że zmiany chromosomalne zachodzą w nieprzypadkowym schemacie w niedrobnokomórkowym raku płuca. Wydaje się, że zmiany te korelują z określonymi zmianami genetycznymi, skutkującymi złośliwym fenotypem. Co więcej, wiele dowodów eksperymentalnych potwierdza wieloetapową teorię karcynogenezy, zgodnie z którą kumulują się stopniowe zmiany w genomie, co prowadzi do złośliwego fenotypu. Produkt końcowy skumulowanych zmian jest określany przez komórkę pochodzenia oraz liczbę i nasilenie zachodzących zmian. Mamy nadzieję, że uda się ustalić, że wczesne zmiany (wyrażające się zmianami kariotypowymi lub konkretnymi mutacjami punktowymi) mogą być zidentyfikowane, co wskazywałoby na prawdopodobieństwo wystąpienia u danego pacjenta innego nowotworu złośliwego. Informacje te można następnie zastosować w sytuacjach klinicznych, na przykład w celu określenia częstotliwości obserwacji klinicznej za pomocą prześwietlenia klatki piersiowej, przesiewowej bronchoskopii lub cytologii plwociny. Co więcej, zebrane informacje mogą pomóc zidentyfikować jedną lub kilka zmian genetycznych niezbędnych do transformacji, które można następnie zbadać w celu dokładniejszego zdefiniowania procesu transformacji.

Obecność komórek nowotworowych w węzłach chłonnych jest krytycznym parametrem w ocenie stopnia zaawansowania chorych na raka płuca. Ocena węzłów chłonnych jest obecnie wykonywana wyłącznie na podstawie histopatologii. Długoterminowe przeżycie pacjentów z rakiem płuc w stadium IB (brak znanego zajęcia węzłów chłonnych z guzem większym niż 2 cm) jest niższe niż pacjentów w stadium IA (brak znanego zajęcia węzłów chłonnych z guzem mniejszym niż 2 cm) . Podobnie, wskaźniki przeżycia pacjentów, którzy zostali uznani za stadium II w oparciu o histologicznie dodatnie węzły chłonne pierwszego poziomu, często nie są lepsze niż w przypadku pacjentów w wyższym stadium z zajęciem węzłów chłonnych drugiego stopnia. Obserwacje te sugerują, że mikroprzerzuty są często obecne w węzłach chłonnych, których nie można wykryć w ocenie histologicznej. Ta propozycja uzupełni badanie histopatologiczne węzłów chłonnych o metody wykrywające ukryte komórki przerzutowe w celu ustalenia, czy przypisanie pacjentów do wyższego stadium dokładniej odzwierciedla ich obciążenie chorobą. Może to mieć wpływ na dalsze leczenie i wyniki leczenia pacjentów.