Nachweis genetischer Marker von Lungenkrebs

Die mehrstufige Theorie der Karzinogenese umfasst die Entwicklung mehrerer aktivierender genetischer Veränderungen aufgrund der Exposition gegenüber Karzinogenen, entweder primär oder überlagert von bereits bestehenden Mutationen im Genom. Diese Veränderungen führen zur Aktivierung von Protoonkogenen, fehlender Expression von Tumorsuppressorgenen oder Kombinationen der oben genannten, deren Summe zu einer malignen Transformation führt. Detaillierte Analysen von Chromosomenläsionen bei bronchogenem Lungenkrebs zeigen mehrere wiederkehrende Anomalien, einschließlich Deletionen, Duplikationen oder Polysomie der Chromosomen 1, 3, 7 und 20. Aberrationen im kurzen Arm von Chromosom 3 werden insbesondere bei vielen kleinzelligen und nicht-kleinzelligen Lungenkrebsen gefunden, und Polysomie 7 ist ein häufiger Befund bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs. Viele dieser Anomalien haben keine identifizierte Bedeutung, jedoch hat die Anwendung aktueller und sich entwickelnder Techniken der Molekularbiologie spezifische genomische Veränderungen offenbart, die zu bösartigen Phänotypen in mehreren Tumoren führen, zum Beispiel hat die Anwendung von Amplifikationstechniken der Polymerase-Kettenreaktion eine auffällige Häufigkeit von Es wurden Mutationen in den h- und k-ras-Protoonkogenen entdeckt, die mit einer Überexpression von Wachstumsfaktoren oder Rezeptoren verbunden sind, beispielsweise dem epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor.

Da alle Epithelzellen ähnlichen Umweltbedingungen ausgesetzt sind, scheint es wahrscheinlich, dass viele Zellen gleichzeitig eine Mutagenese durchlaufen. Klinisch ist dies häufig offensichtlich, da bei 10–20 % der Patienten mit Lungenkrebs gleichzeitig oder zu einem späteren Zeitpunkt in ihrem Verlauf ein weiterer Epithelkrebs auftritt. Die Prädisposition für die Entwicklung von Zweitmalignomen wirkt sich auch auf andere Epitheloberflächen aus, beispielsweise besteht bei Patienten mit Kopf-Hals-Krebs eine starke Tendenz, einen Zweitmalignom (bronchogener Lungenkrebs) im Aerodigestivtrakt zu entwickeln. Trotz des Rückgangs der Raucherquote in den Vereinigten Staaten insgesamt deuten Prognosen darauf hin, dass es bis 2025 immer noch 100.000 Todesfälle durch Lungenkrebs und andere mit Rauchen verbundene Krebsarten geben wird. Daher wäre es für Patienten mit einem Lungenkrebsrisiko von großem Nutzen, diese Veränderungen vor der Entwicklung invasiver bösartiger Läsionen zu erkennen. Dies gilt insbesondere für Patienten, die bereits an Krebs erkrankt sind, oder für Patienten mit einer starken Familienanamnese, die möglicherweise beruflich (z. B. Asbest) oder gewohnheitsmäßig (z. B. Zigarettenrauch) Karzinogenen ausgesetzt sind. Die Identifizierung von Krebserkrankungen im präklinischen Stadium wurde bereits früher versucht, beispielsweise mit Screening-Thorax-Röntgenaufnahmen oder Sputum-Zytologien, jedoch haben sich diese Ansätze nicht als vorteilhaft erwiesen, da die derzeitigen Nachweismethoden nicht empfindlich genug sind, um sie frühzeitig zu erkennen, nicht - phänotypische Veränderungen. Der hier skizzierte Vorschlag soll diese Frage klären, indem Bronchialgewebe von Patienten mit einem Risiko für die Entwicklung eines zweiten Krebses (Patienten, die sich einer primären Resektion zur Heilung von bronchogenem Lungenkrebs unterziehen) untersucht und das Biopsiegewebe auf das Vorhandensein von Chromosomenanomalien und Mutationen in untersucht werden die h- und k-ras-Protoonkogene. Diese Veränderungen können über lange Zeiträume in Epithelzellen der Atemwege vorhanden sein, bevor sich offensichtliche pathologische Veränderungen entwickeln, und Methoden zur Erkennung dieser Veränderungen wären nützlich, um Patienten mit einem Risiko für die Entwicklung von Malignität zu beurteilen und zu verfolgen.

Bedeutung des Lymphknotenstatus bei Lungenkrebs: Bei Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) ist das Tumorstadium der stärkste Prognosefaktor. Die Stratifizierung von Patienten in Stadien erleichtert individuelle Behandlungsentscheidungen basierend auf den Überlebensstatistiken einer Population. Innerhalb dieser abgestuften Populationen erleiden jedoch Untergruppen von Patienten mit offensichtlich früher Erkrankung immer noch ein Wiederauftreten des Krebses. Dies liegt an der Unfähigkeit aktueller Staging-Methoden, bei diesen Patienten eine kleine Anzahl von disseminierten Tumorzellen (Mikrometastasen) nachzuweisen. Reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR) für krebsbezogene Boten-RNAs hat gezeigt, dass sie das Vorhandensein von Mikrometastasen in histologisch negativen Lymphknotenproben nachweist, und diese Befunde korrelieren mit einem schlechten Ergebnis. Leider wurde die routinemäßige klinische Anwendung dieser Technik durch "falsch positive" Ergebnisse in Kontrollgeweben und eine geringe Spezifität für die Vorhersage eines Wiederauftretens der Krankheit eingeschränkt. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die quantitative RT-PCR (QRT-PCR) zwischen echten und falschen positiven Ergebnissen unterscheiden kann und dass dies zu einer verbesserten Fähigkeit führt, ein Wiederauftreten vorherzusagen. In diesem Vorschlag beabsichtigen wir, Lymphknoten von Patienten, die sich einer chirurgischen Resektion für NSCLC unterziehen, mittels quantitativer RT-PCR zu analysieren. Diese Patienten werden dann fünf Jahre lang beobachtet, um ein Wiederauftreten des Tumors festzustellen. Ziel ist es, mittels QRT-PCR zu versuchen und zu identifizieren, bei welchen Patienten das höchste Risiko für ein Wiederauftreten der Krankheit besteht und wer daher von aggressiveren Therapien profitieren könnte.

Spezifische Ziele

1. Zur Gewinnung und Aufrechterhaltung in Zellkultur von „normalen“ Bronchialepithelzellen (NBECs) und Tumoren von Patienten, die sich einer Resektion zur Behandlung von Lungenkarzinomen und Mesotheliomen unterziehen.
2. Ernte von NBEC und Lungentumoren zur Bewertung genetischer Anomalien.
3. Zur Durchführung molekularer Analysen einschließlich Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Amplifikation, Durchflusszytometrie, Immunhistochemie und Genanalyse von Material aus NBECs, Tumoren, benachbarter und normaler Lunge und Blut zur Bewertung, wie z. B. Mutationen in den K-ras- und p53-Protoonkogenen als andere Kandidatengene und -wege, wie diejenigen, die am Übergang von Epithel zu Mesenchym beteiligt sind. Darüber hinaus werden wir nach Mutationen und Veränderungen der Expression von Fas, Fas-Ligand und FADD suchen, drei Molekülen, die den programmierten Zelltod vermitteln und von denen kürzlich gezeigt wurde, dass sie auf mehreren Tumorzellen, einschließlich Lungenkrebs, exprimiert werden.
4. Zur Analyse von Zytokinen, die in Spülflüssigkeit, Tumoren und Lungengewebe vorhanden sind.
5. Herstellung von T-Zellkulturen aus Zellen, die in tumordrainierenden Lymphknoten und in Tumorgewebe vorhanden sind. Zur Isolierung, numerischen Erweiterung sowie phänotypischen und funktionellen Charakterisierung humaner tumorinfiltrierender Lymphozyten (TILs) und Tumorzellen für die potenzielle Entwicklung zukünftiger klinischer Studien zur Zelltherapie.
6. Analyse intrapulmonaler und mediastinaler Lymphknoten auf die Expression tumorbezogener mRNAs (wie karzinoembryonales Antigen (CEA), Cytokeratin-19, Hepatozyten-Wachstumsfaktor, Gastrin-Releasing-Peptid (GRP)-Rezeptor und Neuromedin-B (NMB)-Rezeptor). ) als möglicher Hinweis auf Mikrometastasen.
7. Zum Nachweis eines metastasierten Tumors im Knochenmark, das aus verworfenem Rippenresektionsmaterial extrahiert wurde.
8. Analyse von Biomarkern und zirkulierender Tumor-DNA (ctDNA) in biologischen Proben und Korrelation mit bildgebenden Analysen und Ergebnissen.
9. Durchführung von genomischen, proteomischen, metabolomischen, Mikrobiom- und immunologischen Forschungsstudien an gesammelten Proben.

Bedeutung

Mehrere Forscher haben bereits festgestellt, dass chromosomale Veränderungen in einem nicht zufälligen Muster bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs auftreten. Es scheint, dass diese Veränderungen mit spezifischen genetischen Veränderungen korrelieren, was zu dem malignen Phänotyp führt. Darüber hinaus unterstützen viele experimentelle Beweise die mehrstufige Theorie der Karzinogenese, bei der sich inkrementelle Veränderungen im Genom akkumulieren, was zum bösartigen Phänotyp führt. Das Endprodukt der akkumulierten Änderungen wird durch die Ursprungszelle und die Anzahl und Schwere der auftretenden Änderungen bestimmt. Wir hoffen festzustellen, dass frühe Veränderungen (wie sie durch karyotypische Veränderungen oder durch bestimmte Punktmutationen ausgedrückt werden) identifiziert werden können, die die Wahrscheinlichkeit anzeigen würden, dass ein bestimmter Patient eine andere Malignität entwickelt. Diese Informationen könnten dann auf klinische Situationen angewendet werden, um beispielsweise die Häufigkeit der klinischen Nachsorge durch Thoraxröntgen, Screening-Bronchoskopie oder Sputumzytologie zu bestimmen. Darüber hinaus könnten die gesammelten Informationen dabei helfen, eine oder wenige genetische Veränderungen zu identifizieren, die für die Transformation erforderlich sind, die dann untersucht werden könnten, um den Transformationsprozess weiter zu definieren.

Das Vorhandensein bösartiger Zellen in Lymphknoten ist ein kritischer Parameter bei der Einstufung von Lungenkrebspatienten. Die Beurteilung von Lymphknoten erfolgt derzeit allein durch die Histopathologie. Das Langzeitüberleben von Lungenkrebspatienten im Stadium IB (kein bekannter Lymphknotenbefall bei einem Tumor größer als 2 cm) ist geringer als bei Patienten im Stadium IA (kein bekannter Lymphknotenbefall bei einem Tumor kleiner als 2 cm). . Ebenso sind die Überlebensraten von Patienten, die aufgrund histologisch positiver Lymphknoten der Stufe 1 als Stadium II eingestuft werden, oft nicht besser als die von Patienten im höheren Stadium, die eine Lymphknotenbeteiligung der Stufe 2 aufweisen. Diese Beobachtungen legen nahe, dass Mikrometastasen häufig in Lymphknoten vorhanden sind, die durch histologische Beurteilung nicht nachweisbar sind. Dieser Vorschlag wird die histopathologische Untersuchung von Lymphknoten durch Methoden ergänzen, die okkulte metastatische Zellen erkennen, um festzustellen, ob die Zuordnung von Patienten zu einem höheren Stadium ihre Krankheitslast genauer widerspiegelt. Dies könnte sich auf die nachfolgende Behandlung und die Behandlungsergebnisse auswirken.