Asociace mezi polymorfismem receptoru vitaminu D a hladinami vitaminu D v séru u dětí s nízkoenergetickými zlomeninami

Studijní soubor tvořilo 100 dětí ve věku 3 až 18 let (78 % chlapců) hospitalizovaných na Klinice dětské ortopedie v letech 2011-2013 pro nízkoenergetické zlomeniny. Kontrolní soubor (122 dětí, 68 % chlapců) tvořily děti ve věku 3 až 17 let, hospitalizované z jiných důvodů (úrazy, diagnostika poranění kolenních vazů a další) bez zlomenin. Děti s osteogenesis imperfecta (OI) byly ze studie vyloučeny. Od každého pacienta a jeho rodiče/opatrovníka byl získán písemný informovaný souhlas s účastí ve studii. Nízkoenergetická zlomenina byla definována jako zlomenina způsobená pádem z pacientovy vlastní výšky nebo pádem během týmových her. Všechny zlomeniny byly rentgenologicky potvrzeny.

Během hospitalizace pacienti a jejich rodiče vyplnili dotazník o demografických údajích, místě bydliště (město/venkov), dřívějších zlomeninách a fyzické aktivitě. Stupeň pohlavní zralosti byl hodnocen pomocí průzkumu vývoje puberty na základě Puberty Development Scale [20-22]. Byla změřena tělesná hmotnost a výška pacientů a byl vypočítán Coleův indikátor pro posouzení nutričního stavu pacientů.

Sérové ​​koncentrace celkového vitaminu D [25-hydroxy vitaminu D3 ((25(OH)D3)) plus 25-hydroxy vitaminu D2 ((25(OH)D2))] v plazmě všech dětí byly stanoveny elektrochemiluminiscencí pomocí paramagnetického částice potažené streptavidinem a sloučeninou ruthenia na přístroji Cobas e 411 od Roche. Podle naší laboratoře bylo rozmezí referenčních hodnot pro celkový vitamin D 30,0 - 74,0 ng/ml. Vzorky plné krve byly odebírány do zkumavek obsahujících EDTA a skladovány při -20°C. DNA byla izolována pomocí MasterPureTM DNA Purification Kit (Akor Laboratories) a kvantifikována na spektrofotometru (Nanodrop 2000, Thermo Scientific). Genotypy pro čtyři polymorfismy délky restrikčních fragmentů genu receptoru vitaminu D (VDR) byly stanoveny standardními technikami polymerázové řetězové reakce (PCR) a enzymatickým štěpením produktů pomocí FokI, Apal, TaqI a BsmI (Thermo Scientific). Stručně řečeno, PCR byly provedeny v konečném objemu 20 ul obsahujícím 50-100 ng DNA, 0,3 uM každého primeru a JumpStartTM REDTaqTM ReadyMixTM (Sigma). Po počáteční denaturaci po dobu 3 minut při 94 °C byly vzorky podrobeny 35 cyklům amplifikace, sestávající z 30sekundové denaturační fáze při 94 °C, 30sekundové fáze žíhání (FokI při 60 °C, Apal a TaqI při 70 °C, BsmI při 62 °C), 30s prodlužovací fáze při 72 °C a 4 min při 72 °C na termocykleru Bio-Rad CFX96TM. Primery použité pro FokI polymorfismus byly: přímý 5'-AGC TGG CCC TGG CAC TGA CTC TGC TCT-3', reverzní 5'-ATG GAA ACA CCT TGC TTC TTC TCC CTC-3'; ApaI a TaqI: vpřed 5'-CAG AGC ATG GAC AGG GAG CAA-3', vzad 5'-GCA ACT CCT CAT GGC TGA GGT CTC-3' a BsmI: vpřed 5'-AGT GTG CAG GCG ATT CGT AG-3 ', reverzní 5'-ATA GGC AGA ACC ATC TCT CAG-3' [25]. Produkty PCR byly štěpeny podle pokynů výrobce a separovány na 2% agarózovém gelu. Polymorfismy byly dokumentovány fotografováním pod UV osvětlením pomocí G:Box (Syngene). Pro ověření výsledků byla opakována náhodná podskupina (20 % vzorků). Velká písmena „F“, „A“, „T“ a „B“ označují nepřítomnost místa řezu pro polymorfismy FokI, Apal, TaqI a BsmI, zatímco malá písmena „f“, „a“, „ t" a "b" označují jeho přítomnost. Ke zkoumání vztahů mezi kvalitativními atributy byl použit Chí-kvadrát test nezávislosti a Fisherův exaktní test. Normalita distribuce byla ověřena pomocí Kolmogorova-Smirnovova testu s Lillieforsovou korekcí významnosti a Shapiro-Wilkovým testem. Nebylo analyzováno žádné normální rozdělení kvantitativních proměnných. Pro srovnání kvantitativních proměnných bez normálního rozdělení byl použit neparametrický Mann - Whitney U test. Byly vytvořeny modely jednorozměrné a vícerozměrné lineární regrese a logistické regrese. Výsledky byly považovány za statisticky významné při p <0,05. Výpočty byly provedeny pomocí Statistica 10.0 od StatSoft, IBM SPSS Statistics 21.0 od Predictive Solutions Company a balíčků Stata / IC 13.1 od StataCorp LP