Forbindelse mellem D-vitamin-receptorpolymorfi og serum-vitamin D-niveauer hos børn med lavenergifrakturer

Undersøgelsesgruppen bestod af 100 børn i alderen 3 til 18 år (78 % drenge) indlagt på afdelingen for pædiatrisk ortopædi i 2011-2013 på grund af lav-energi frakturer. Kontrolgruppen (122 børn, 68 % drenge) bestod af børn i alderen 3 til 17 år, indlagt af andre årsager (skader, diagnose af ledbåndsskader i knæet og andre) uden brud. Børn med osteogenesis imperfecta (OI) blev udelukket fra undersøgelsen. Fra hver patient og deres forælder/værge blev der indhentet et skriftligt informeret samtykke til at deltage i undersøgelsen. Lavenergifraktur blev defineret som et brud som følge af et fald fra patientens egen højde eller et fald under holdspil. Alle frakturer blev radiologisk bekræftet.

Under indlæggelsen udfyldte patienterne og deres forældre et spørgeskema om demografiske data, bopæl (by/land), tidligere frakturer og fysisk aktivitet. Graden af ​​seksuel modenhed blev vurderet ved hjælp af en undersøgelse af pubertetsudviklingen på baggrund af Puberty Development Scale [20-22]. Patienternes kropsvægt og højder blev målt, og Cole-indikatoren blev beregnet for at vurdere patienternes ernæringstilstand.

Serumkoncentrationer af total D-vitamin [25-hydroxy-vitamin D3 ((25(OH)D3)) plus 25-hydroxy-vitamin D2 ((25(OH)D2))] i plasmaet af alle børn blev bestemt ved elektrokemiluminescens ved hjælp af paramagnetisk partikler belagt med streptavidin og rutheniumforbindelse på Cobas e 411-apparatet fra Roche. Ifølge vores laboratorium var referenceværdiområdet for totalt D-vitamin 30,0 - 74,0 ng/ml. Fuldblodsprøver blev opsamlet i rør indeholdende EDTA og opbevaret ved -20°C. DNA blev isoleret ved hjælp af MasterPureTM DNA Purification Kit (Akor Laboratories) og kvantificeret på et spektrofotometer (Nanodrop 2000, Thermo Scientific). Genotyperne for fire restriktionsfragmentlængde polymorfismer af vitamin D-receptor (VDR) genet blev bestemt ved standard polymerase kædereaktion (PCR) teknikker og enzymatisk fordøjelse af produkterne med FokI, ApaI, TaqI og BsmI (Thermo Scientific). Kort sagt blev PCR udført i et slutvolumen på 20 µl indeholdende 50-100 ng DNA, 0,3 µM af hver primer og JumpStartTM REDTaqTM ReadyMixTM (Sigma). Efter indledende denaturering i 3 minutter ved 94 °C blev prøver udsat for 35 cyklusser af amplifikation, bestående af en 30-sekunders denatureringsfase ved 94 °C, en 30-sekunders annealingsfase (FokI ved 60 °C, ApaI og TaqI ved 70 °C, BsmI ved 62 °C), en 30-sekunders forlængelsesfase ved 72 °C og 4 minutter ved 72 °C på en Bio-Rad termisk cycler CFX96TM. Primerne anvendt til FokI polymorfi var: fremad 5'-AGC TGG CCC TGG CAC TGA CTC TGC TCT-3', omvendt 5'-ATG GAA ACA CCT TGC TTC TTC TCC CTC-3'; ApaI og TaqI: fremad 5'-CAG AGC ATG GAC AGG GAG CAA-3', omvendt 5'-GCA ACT CCT CAT GGC TGA GGT CTC-3' og BsmI: fremad 5'-AGT GTG CAG GCG ATT CGT AG-3 ', omvendt 5'-ATA GGC AGA ACC ATC TCT CAG-3' [25]. PCR-produkterne blev fordøjet i overensstemmelse med producentens instruktioner og adskilt på 2% agarosegel. Polymorfismerne blev dokumenteret ved fotografering under UV-belysning under anvendelse af G:Box (Syngene). En tilfældig delmængde (20 % af prøverne) blev gentaget for at verificere resultaterne. Store bogstaver "F", "A", "T" og "B" angiver fraværet af skæringsstedet for henholdsvis FokI, ApaI, TaqI og BsmI polymorfismer, hvorimod små bogstaver "f", "a", " t", og "b" angiver dets tilstedeværelse. For at undersøge sammenhængen mellem kvalitetsattributter blev Chi-square test af uafhængighed og Fishers eksakte test brugt. Normaliteten af ​​fordelingen blev verificeret ved hjælp af Kolmogorov-Smirnov-testen med Lilliefors signifikanskorrektion og Shapiro-Wilk-testen. Der var ingen normalfordeling af analyserede kvantitative variabler. For at sammenligne de kvantitative variable uden normalfordeling blev en ikke-parametrisk Mann - Whitney U-test brugt. Modeller for univariat og multivariat lineær regression og logistisk regression blev etableret. Resultater blev betragtet som statistisk signifikante ved p <0,05. Beregningerne blev udført ved hjælp af Statistica 10.0 af StatSoft, IBM SPSS Statistics 21.0 af Predictive Solutions Company og Stata / IC 13.1-pakker af StataCorp LP