Asociación entre el polimorfismo del receptor de vitamina D y los niveles séricos de vitamina D en niños con fracturas de baja energía

El grupo de estudio estuvo formado por 100 niños de 3 a 18 años (78% varones) hospitalizados en el Departamento de Ortopedia Pediátrica en 2011-2013 por fracturas de baja energía. El grupo control (122 niños, 68% varones) estuvo formado por niños de 3 a 17 años, hospitalizados por otros motivos (lesiones, diagnóstico de lesiones de ligamentos de rodilla y otros) sin fracturas. Los niños con osteogénesis imperfecta (OI) fueron excluidos del estudio. De cada paciente y su padre/tutor se obtuvo un consentimiento informado por escrito para participar en el estudio. La fractura de baja energía se definió como una fractura sufrida por una caída desde la propia altura del paciente o una caída durante los juegos de equipo. Todas las fracturas fueron confirmadas radiológicamente.

Durante la hospitalización los pacientes y sus padres cumplimentaron un cuestionario sobre datos demográficos, lugar de residencia (urbano/rural), fracturas anteriores y actividad física. El grado de madurez sexual se evaluó mediante una encuesta de desarrollo de la pubertad sobre la base de la Escala de Desarrollo de la Pubertad [20-22]. Se midió el peso corporal y la talla de los pacientes, y se calculó el indicador de Cole para evaluar el estado nutricional de los pacientes.

Las concentraciones séricas de vitamina D total [25-hidroxi vitamina D3 ((25(OH)D3)) más 25-hidroxi vitamina D2 ((25(OH)D2))] en el plasma de todos los niños se determinaron mediante electroquimioluminiscencia utilizando partículas recubiertas con estreptavidina y compuesto de rutenio en el aparato Cobas e 411 de Roche. Según nuestro laboratorio, el rango de valores de referencia para la vitamina D total fue de 30,0 a 74,0 ng/ml. Las muestras de sangre completa se recogieron en tubos que contenían EDTA y se almacenaron a -20 °C. El ADN se aisló utilizando el kit de purificación de ADN MasterPureTM (Akor Laboratories) y se cuantificó en un espectrofotómetro (Nanodrop 2000, Thermo Scientific). Los genotipos para cuatro polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción del gen del receptor de vitamina D (VDR) se determinaron mediante técnicas estándar de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y digestión enzimática de los productos con FokI, ApaI, TaqI y BsmI (Thermo Scientific). En resumen, las PCR se realizaron en un volumen final de 20 µl que contenía 50-100 ng de ADN, 0,3 µM de cada cebador y JumpStartTM REDTaqTM ReadyMixTM (Sigma). Después de la desnaturalización inicial durante 3 minutos a 94 °C, las muestras se sometieron a 35 ciclos de amplificación, que consistieron en una fase de desnaturalización de 30 segundos a 94 °C, una fase de hibridación de 30 segundos (FokI a 60 °C, ApaI y TaqI a 70 °C, BsmI a 62 °C), una fase de extensión de 30 s a 72 °C y 4 min a 72 °C en un termociclador Bio-Rad CFX96TM. Los cebadores utilizados para el polimorfismo FokI fueron: 5'-AGC directo TGG CCC TGG CAC TGA CTC TGC TCT-3', 5'-ATG inverso GAA ACA CCT TGC TTC TTC TCC CTC-3'; ApaI y TaqI: adelante 5'-CAG AGC ATG GAC AGG GAG CAA-3', atrás 5'-GCA ACT CCT CAT GGC TGA GGT CTC-3' y BsmI: adelante 5'-AGT GTG CAG GCG ATT CGT AG-3 ', revertir 5'-ATA GGC AGA ACC ATC TCT CAG-3' [25]. Los productos de PCR se digirieron de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se separaron en gel de agarosa al 2%. Los polimorfismos se documentaron fotografiando bajo iluminación UV usando G:Box (Syngene). Se repitió un subconjunto aleatorio (20 % de las muestras) para verificar los resultados. Las letras mayúsculas "F", "A", "T" y "B" indican la ausencia del sitio de corte para los polimorfismos FokI, ApaI, TaqI y BsmI, respectivamente, mientras que las letras minúsculas "f", "a", " t" y "b" indican su presencia. Para examinar las relaciones entre los atributos de calidad se utilizó la prueba de independencia Chi-cuadrado y la prueba exacta de Fisher. La normalidad de la distribución se verificó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov con la corrección de significación de Lilliefors y la prueba de Shapiro-Wilk. No hubo distribución normal de las variables cuantitativas analizadas. Para comparar las variables cuantitativas sin distribución normal se utilizó la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney. Se establecieron modelos de regresión lineal univariante y multivariante y regresión logística. Los resultados se consideraron estadísticamente significativos a p <0,05. Los cálculos se realizaron utilizando Statistica 10.0 de StatSoft, IBM SPSS Statistics 21.0 de Predictive Solutions Company y paquetes Stata/IC 13.1 de StataCorp LP