Assoziation zwischen Vitamin-D-Rezeptorpolymorphismus und Serum-Vitamin-D-Spiegeln bei Kindern mit Niedrigenergiefrakturen

Die Studiengruppe bestand aus 100 Kindern im Alter von 3 bis 18 Jahren (78 % Jungen), die in den Jahren 2011-2013 aufgrund von Niedrigenergiefrakturen in der Abteilung für Kinderorthopädie stationär behandelt wurden. Die Kontrollgruppe (122 Kinder, 68 % Jungen) bestand aus Kindern im Alter von 3 bis 17 Jahren, die aus anderen Gründen (Verletzungen, Diagnose von Kniebandverletzungen und anderen) ohne Frakturen ins Krankenhaus eingeliefert wurden. Kinder mit Osteogenesis imperfecta (OI) wurden von der Studie ausgeschlossen. Von jedem Patienten und seinen Eltern/Erziehungsberechtigten wurde eine schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme an der Studie eingeholt. Eine Niedrigenergiefraktur wurde als eine Fraktur definiert, die durch einen Sturz aus der eigenen Höhe des Patienten oder einen Sturz während eines Mannschaftsspiels erlitten wurde. Alle Frakturen wurden radiologisch bestätigt.

Während des Krankenhausaufenthalts füllten die Patienten und ihre Eltern einen Fragebogen zu demografischen Daten, dem Wohnort (Stadt/Land), früheren Frakturen und körperlichen Aktivitäten aus. Der Grad der Geschlechtsreife wurde anhand einer Erhebung zur Pubertätsentwicklung auf Basis der Puberty Development Scale [20-22] erfasst. Das Körpergewicht und die Körpergröße der Patienten wurden gemessen, und der Cole-Indikator wurde berechnet, um den Ernährungszustand der Patienten zu beurteilen.

Die Serumkonzentrationen von Gesamt-Vitamin D [25-Hydroxy-Vitamin D3 ((25(OH)D3)) plus 25-Hydroxy-Vitamin D2 ((25(OH)D2))] im Plasma aller Kinder wurden durch Elektrochemilumineszenz unter Verwendung von Paramagnetismus bestimmt mit Streptavidin und Rutheniumverbindung beschichtete Partikel auf dem Gerät Cobas e 411 von Roche. Laut unserem Labor lag der Referenzwertbereich für Gesamt-Vitamin D bei 30,0 - 74,0 ng/ml. Vollblutproben wurden in Röhrchen mit EDTA gesammelt und bei -20 °C gelagert. DNA wurde unter Verwendung des MasterPureTM DNA Purification Kit (Akor Laboratories) isoliert und auf einem Spektrophotometer (Nanodrop 2000, Thermo Scientific) quantifiziert. Die Genotypen für vier Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen des Vitamin-D-Rezeptor(VDR)-Gens wurden durch Standardtechniken der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und enzymatischen Verdau der Produkte mit FokI, ApaI, TaqI und BsmI (Thermo Scientific) bestimmt. Kurz gesagt, die PCR wurde in einem Endvolumen von 20 µl durchgeführt, das 50-100 ng DNA, 0,3 µM jedes Primers und JumpStartTM REDTaqTM ReadyMixTM (Sigma) enthielt. Nach anfänglicher Denaturierung für 3 min bei 94 °C wurden die Proben 35 Amplifikationszyklen unterzogen, bestehend aus einer 30-sekündigen Denaturierungsphase bei 94 °C, einer 30-sekündigen Annealingphase (FokI bei 60 °C, ApaI und TaqI bei 70 °C, BsmI bei 62 °C), eine 30-s-Extensionsphase bei 72 °C und 4 min bei 72 °C auf einem Bio-Rad-Thermocycler CFX96TM. Die für den FokI-Polymorphismus verwendeten Primer waren: vorwärts 5'-AGC TGG CCC TGG CAC TGA CTC TGC TCT-3', rückwärts 5'-ATG GAA ACA CCT TGC TTC TTC TCC CTC-3'; ApaI und TaqI: vorwärts 5'-CAG AGC ATG GAC AGG GAG CAA-3', rückwärts 5'-GCA ACT CCT CAT GGC TGA GGT CTC-3' und BsmI: vorwärts 5'-AGT GTG CAG GCG ATT CGT AG-3 ', reverse 5'-ATA GGC AGA ACC ATC TCT CAG-3' [25]. Die PCR-Produkte wurden nach Herstellerangaben verdaut und auf 2 % Agarosegel aufgetrennt. Die Polymorphismen wurden durch Fotografieren unter UV-Beleuchtung unter Verwendung von G:Box (Syngene) dokumentiert. Eine zufällige Teilmenge (20 % der Proben) wurde wiederholt, um die Ergebnisse zu verifizieren. Großbuchstaben „F“, „A“, „T“ und „B“ zeigen das Fehlen der Schnittstelle für FokI-, ApaI-, TaqI- bzw. BsmI-Polymorphismen an, während Kleinbuchstaben „f“, „a“, „ t" und "b" weisen auf sein Vorhandensein hin. Um die Beziehungen zwischen Qualitätsattributen zu untersuchen, wurden der Chi-Quadrat-Test auf Unabhängigkeit und der exakte Test nach Fisher verwendet. Die Normalverteilung wurde mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test mit Lilliefors-Signifikanzkorrektur und dem Shapiro-Wilk-Test verifiziert. Es gab keine Normalverteilung der analysierten quantitativen Variablen. Zum Vergleich der quantitativen Variablen ohne Normalverteilung wurde ein nichtparametrischer Mann-Whitney-U-Test verwendet. Es wurden Modelle der univariaten und multivariaten linearen Regression und der logistischen Regression etabliert. Die Ergebnisse wurden bei p < 0,05 als statistisch signifikant angesehen. Die Berechnungen wurden mit Statistica 10.0 von StatSoft, IBM SPSS Statistics 21.0 von Predictive Solutions Company und Stata / IC 13.1 Paketen von StataCorp LP durchgeführt