Associação entre o polimorfismo do receptor de vitamina D e os níveis séricos de vitamina D em crianças com fraturas de baixa energia

O grupo de estudo consistiu de 100 crianças de 3 a 18 anos (78% meninos) internadas no Departamento de Ortopedia Pediátrica em 2011-2013 devido a fraturas de baixa energia. O grupo controle (122 crianças, 68% meninos) foi composto por crianças de 3 a 17 anos, internadas por outros motivos (lesões, diagnóstico de lesões ligamentares do joelho e outras) sem fraturas. Crianças com osteogênese imperfeita (OI) foram excluídas do estudo. De cada paciente e de seus pais/responsáveis ​​foi obtido um consentimento informado por escrito para participar do estudo. Fratura de baixa energia foi definida como uma fratura sofrida por queda da própria altura do paciente ou queda durante jogos da equipe. Todas as fraturas foram confirmadas radiologicamente.

Durante a internação, os pacientes e seus pais responderam a um questionário sobre dados demográficos, local de residência (urbano/rural), fraturas anteriores e atividade física. O grau de maturidade sexual foi avaliado usando uma pesquisa de desenvolvimento da puberdade com base na Escala de Desenvolvimento da Puberdade [20-22]. O peso corporal e a altura dos pacientes foram medidos e o indicador de Cole foi calculado para avaliar o estado nutricional dos pacientes.

As concentrações séricas de vitamina D total [25-hidroxivitamina D3 ((25(OH)D3)) mais 25-hidroxivitamina D2 ((25(OH)D2))] no plasma de todas as crianças foram determinadas por eletroquimioluminescência usando paramagnética partículas revestidas com estreptavidina e composto de rutênio no aparelho Cobas e 411 da Roche. De acordo com nosso laboratório, a faixa de valores de referência para vitamina D total foi de 30,0 - 74,0 ng/ml. Amostras de sangue total foram coletadas em tubos contendo EDTA e armazenadas a -20°C. O DNA foi isolado usando o MasterPureTM DNA Purification Kit (Akor Laboratories) e quantificado em um espectrofotômetro (Nanodrop 2000, Thermo Scientific). Os genótipos para polimorfismos de comprimento de quatro fragmentos de restrição do gene do receptor de vitamina D (VDR) foram determinados por técnicas padrão de reação em cadeia da polimerase (PCR) e digestão enzimática dos produtos com FokI, ApaI, TaqI e BsmI (Thermo Scientific). Resumindo, a PCR foi realizada em um volume final de 20 µl contendo 50-100 ng de DNA, 0,3 µM de cada primer e JumpStartTM REDTaqTM ReadyMixTM (Sigma). Após a desnaturação inicial por 3 minutos a 94 °C, as amostras foram submetidas a 35 ciclos de amplificação, consistindo em uma fase de desnaturação de 30 segundos a 94 °C, uma fase de recozimento de 30 segundos (FokI a 60 °C, ApaI e TaqI a 70 °C, BsmI a 62 °C), uma fase de extensão de 30 s a 72 °C e 4 min a 72 °C em um termociclador Bio-Rad CFX96TM. Os primers usados ​​para o polimorfismo FokI foram: 5'-AGC direto TGG CCC TGG CAC TGA CTC TGC TCT-3', 5'-ATG GAA reverso ACA CCT TGC TTC TTC TCC CTC-3' reverso; ApaI e TaqI: direto 5'-CAG AGC ATG GAC AGG GAG CAA-3', reverso 5'-GCA ACT CCT CAT GGC TGA GGT CTC-3' e BsmI: direto 5'-AGT GTG CAG GCG ATT CGT AG-3 ', reverso 5'-ATA GGC AGA ACC ATC TCT CAG-3' [25]. Os produtos de PCR foram digeridos de acordo com as instruções do fabricante e separados em gel de agarose 2%. Os polimorfismos foram documentados por fotografia sob iluminação UV usando G:Box (Syngene). Um subconjunto aleatório (20% das amostras) foi repetido para verificar os resultados. As letras maiúsculas "F", "A", "T" e "B" indicam a ausência do local de corte para os polimorfismos FokI, ApaI, TaqI e BsmI, respectivamente, enquanto as letras minúsculas "f", "a", " t" e "b" indicam sua presença. Para examinar as relações entre os atributos de qualidade, foram usados ​​o teste qui-quadrado de independência e o teste exato de Fisher. A normalidade da distribuição foi verificada por meio do teste de Kolmogorov-Smirnov com correção de significância de Lilliefors e teste de Shapiro-Wilk. Não houve distribuição normal das variáveis ​​quantitativas analisadas. Para comparar as variáveis ​​quantitativas sem distribuição normal foi utilizado o teste não paramétrico U de Mann - Whitney. Foram estabelecidos modelos de regressão linear univariada e multivariada e de regressão logística. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos com p < 0,05. Os cálculos foram realizados usando Statistica 10.0 da StatSoft, IBM SPSS Statistics 21.0 da Predictive Solutions Company e pacotes Stata/IC 13.1 da StataCorp LP