Associazione tra polimorfismo del recettore della vitamina D e livelli sierici di vitamina D nei bambini con fratture a bassa energia

Il gruppo di studio era composto da 100 bambini di età compresa tra 3 e 18 anni (78% maschi) ricoverati presso il Dipartimento di Ortopedia Pediatrica nel 2011-2013 a causa di fratture a bassa energia. Il gruppo di controllo (122 bambini, 68% ragazzi) era costituito da bambini dai 3 ai 17 anni, ricoverati per altri motivi (lesioni, diagnosi di lesioni ai legamenti del ginocchio e altri) senza fratture. I bambini con osteogenesi imperfetta (OI) sono stati esclusi dallo studio. Da ciascun paziente e dal suo genitore/tutore è stato ottenuto un consenso informato scritto a partecipare allo studio. La frattura a bassa energia è stata definita come una frattura subita da una caduta dall'altezza del paziente o da una caduta durante i giochi di squadra. Tutte le fratture sono state confermate radiologicamente.

Durante il ricovero i pazienti ei loro genitori hanno compilato un questionario sui dati demografici, il luogo di residenza (urbano/rurale), le fratture pregresse e l'attività fisica. Il grado di maturità sessuale è stato valutato utilizzando un'indagine sullo sviluppo della pubertà sulla base della Puberty Development Scale [20-22]. Sono stati misurati il ​​peso corporeo e l'altezza dei pazienti ed è stato calcolato l'indicatore Cole per valutare lo stato nutrizionale dei pazienti.

Le concentrazioni sieriche di vitamina D totale [25-idrossi vitamina D3 ((25(OH)D3)) più 25-idrossi vitamina D2 ((25(OH)D2))] nel plasma di tutti i bambini sono state determinate mediante elettrochemiluminescenza mediante paramagnetico particelle rivestite con streptavidina e composto di rutenio sull'apparato Cobas e 411 di Roche. Secondo il nostro laboratorio, l'intervallo di valori di riferimento per la vitamina D totale era 30,0 - 74,0 ng/ml. I campioni di sangue intero sono stati raccolti in provette contenenti EDTA e conservati a -20°C. Il DNA è stato isolato utilizzando il kit di purificazione del DNA MasterPureTM (Akor Laboratories) e quantificato su uno spettrofotometro (Nanodrop 2000, Thermo Scientific). I genotipi per quattro polimorfismi della lunghezza del frammento di restrizione del gene del recettore della vitamina D (VDR) sono stati determinati mediante tecniche standard di reazione a catena della polimerasi (PCR) e digestione enzimatica dei prodotti con FokI, ApaI, TaqI e BsmI (Thermo Scientific). In breve, la PCR è stata eseguita in un volume finale di 20 µl contenente 50-100 ng di DNA, 0,3 µM di ciascun primer e JumpStartTM REDTaqTM ReadyMixTM (Sigma). Dopo la denaturazione iniziale per 3 minuti a 94 °C, i campioni sono stati sottoposti a 35 cicli di amplificazione, consistenti in una fase di denaturazione di 30 secondi a 94 °C, una fase di ricottura di 30 secondi (FokI a 60 °C, ApaI e TaqI a 70 °C, BsmI a 62 °C), una fase di estensione di 30 s a 72 °C e 4 minuti a 72 °C su un termociclatore Bio-Rad CFX96TM. I primer utilizzati per il polimorfismo FokI erano: forward 5'-AGC TGG CCC TGG CAC TGA CTC TGC TCT-3', reverse 5'-ATG GAA ACA CCT TGC TTC TTC TCC CTC-3'; ApaI e TaqI: avanti 5'-CAG AGC ATG GAC AGG GAG CAA-3', indietro 5'-GCA ACT CCT CAT GGC TGA GGT CTC-3' e BsmI: avanti 5'-AGT GTG CAG GCG ATT CGT AG-3 ', inverso 5'-ATA GGC AGA ACC ATC TCT CAG-3' [25]. I prodotti della PCR sono stati digeriti secondo le istruzioni del produttore e separati su gel di agarosio al 2%. I polimorfismi sono stati documentati fotografando sotto illuminazione UV usando G:Box (Syngene). Un sottoinsieme casuale (20% dei campioni) è stato ripetuto per verificare i risultati. Le lettere maiuscole "F", "A", "T" e "B" indicano rispettivamente l'assenza del sito di taglio per i polimorfismi FokI, ApaI, TaqI e BsmI, mentre le lettere minuscole "f", "a", " t" e "b" indicano la sua presenza. Per esaminare le relazioni tra gli attributi di qualità sono stati utilizzati il ​​test di indipendenza del chi-quadrato e il test esatto di Fisher. La normalità della distribuzione è stata verificata utilizzando il test di Kolmogorov-Smirnov con la correzione della significatività di Lilliefors e il test di Shapiro-Wilk. Non vi era alcuna distribuzione normale delle variabili quantitative analizzate. Per confrontare le variabili quantitative senza distribuzione normale è stato utilizzato un test non parametrico Mann - Whitney U. Sono stati stabiliti modelli di regressione lineare univariata e multivariata e regressione logistica. I risultati sono stati considerati statisticamente significativi a p <0,05. I calcoli sono stati eseguiti utilizzando Statistica 10.0 di StatSoft, IBM SPSS Statistics 21.0 di Predictive Solutions Company e pacchetti Stata/IC 13.1 di StataCorp LP