Covid-19: Možná role neutrofilních extracelulárních pastí (NETSINCOVID)

Proces, při kterém neutrofily vypuzují DNA spolu s různými proteiny ven, vytvářející síťovou strukturu nazývanou Neutrofilní extracelulární pasti (NETs), představuje konkrétní buněčnou smrt, která zahrnuje destrukci jaderné membrány před plazmatickou. Tento proces se nazývá NETóza a liší se od jiných známých forem buněčné smrti, jako je nekróza a apoptóza.

Smrt neutrofilů ejekcí NET (NETosis) byla poprvé popsána v roce 2004 Brinkmanem.

NET, jak naznačuje samotný výraz, představují jakousi síť složenou z vláken DNA, histonů a proteinů pocházejících z neutrofilních granulí, jejichž hlavní funkcí je zachycovat patogeny (zejména bakterie a houby). Tento proces souvisí s vrozenou imunitou. .

Tento proces, je-li však aktivován přehnaným způsobem, sám o sobě znamená lokální nebo systémové poškození.

DNA vyloučená během tohoto procesu je dvouvláknová DNA, podtyp dsDNA. dsDNA, která představuje zlomek DNA dostupné v oběhu (cell free DNA - cfDNA), pochází z různých procesů buněčné smrti, a proto koreluje se stupněm poškození tkáně. U zdravých jedinců je přítomen pouze v malém množství.

Je důležité zdůraznit, jak se během procesu NETosis mění buněčný redoxní stav, což vede k nadměrné produkci volných kyslíkových radikálů (Reactive Oxygen Species, ROS) a k aktivaci enzymu NADPH oxidázy. Vznik NET, a tedy i proces NETózy, byly zpočátku studovány v souvislosti s bakteriálními infekcemi, ale následně se jejich role stále více zjasňovala u jiných stavů, jako je rakovina, autoimunitní onemocnění, plicní onemocnění, ateroskleróza a žilní tromboembolická nemoc.

Zejména se zdá, že NETóza hraje důležitou roli u všech stavů charakterizovaných žilní a arteriální trombózou, jak potvrdily četné důkazy.

NETóza byla také dokumentována na mikrovaskulární úrovni, např. u vaskulitidy, trombotických mikroangiopatií, jako je Moschowitzův syndrom.

Viry jsou známé svou schopností vyhýbat se imunitní reakci těla. Nedávno bylo vidět, že také mohou působit jako spouštěče procesů NETosis.

Ve skutečnosti může mnoho virů stimulovat neutrofily k produkci NET. Byly pozorovány různé reakce neutrofilů, od klasické NETózy, po produkci antivirových látek nebo dokonce po přechod na apoptózu.

Virem indukované NETy (proto komplexy dsDNA, histony, granulární proteiny) mohou začít nekontrolovaně cirkulovat, což vede k extrémní systémové reakci organismu s produkcí imunitních komplexů, cytokinů, interferonu I atd.

Zdá se, že NETóza je úzce spojena se zánětlivou odpovědí. Například je známo, že v neutrofilním granulocytu je protein PAD4 přítomen v jádře, dekondenzuje chromatin a podporuje tvorbu NET. Na druhé straně se NET zvyšuje u pacientů se syndromem akutní respirační tísně (ARDS), jak bylo pozorováno ve studiích o tekutině z bronchoalveolární laváže, stejně jako u pacientů s akutním respiračním selháním během exacerbace CHOPN.

Je tedy zřejmé, že virem vyvolaná NETóza působí jako dvousečná zbraň: pokud na jedné straně dochází k mechanickému zachycení viru, na druhé straně může být zánětlivá a imunologická reakce spuštěná uvolněním NET sama o sobě škodlivá.

K dnešnímu dni je v literatuře málo údajů o úloze NET při infekci Covid-19, virové infekci, která může vést k vysoce letální intersticiální pneumonii a pro kterou dnes neexistuje žádná vakcína ani specifická terapie. Pokročilé formy COVID-19 jsou často charakterizovány hyperzánětem („cytokinová bouře“) s rozvojem stavu podobného ARDS. Kromě toho se stále častěji objevují zprávy o mikro a makro trombotických jevech, jako je mikroangiopatie, plicní embolie (která vedla k pečlivému hodnocení antitrombotické profylaxe a/nebo koagulace u pacientů s Covid-19).

CÍL STUDIE Primárním cílem studie je pochopit, zda mohou být NET zapojeny do reakce na Covid-19 a jakými mechanismy. Konkrétní terapeutické návrhy by mohly vycházet ze znalosti a posílení této formy vrozené imunity.

K tomu bude nutné vyhodnotit aktivitu NETosis u pacientů s Covid-19 a zhodnotit, zda klinický průběh onemocnění (zhoršení vs hojení) určuje míru aktivity NETosi. Proto bude studována souvislost mezi úmrtností na Covid-19/přežití a aktivitou NETs.

Sekundární cíle se týkají možnosti studia různých asociací mezi markery NETosis a biohumorálními indexy zánětu a mezi markery NETosi a nástupem periferní nebo hluboké žilní trombózy.

Nakonec bude vyhodnocena možnost, že by plazma pacientů s Covid-19 mohla spustit proces NETosis in vitro.

PLÁNOVANÉ POSTUPY a SBĚRANÉ INFORMACE Lékařské vyšetření: (krevní tlak, srdeční frekvence a SpO2, které umožní vyhodnotit přesný poměr PaO2 / FiO2).

Stejně jako v běžné klinické praxi budou pacienti s Covid-19 podstupovat venózní odběry pro stanovení krevního obrazu, kreatininu, lipidového profilu, PCR, D-dimeru, LDH, jaterních funkčních indexů a hladiny glukózy v krvi.

Pro každý předmět bude vypracována přesná anamnéza. Pacienti podstoupí: elektrokardiogram a rentgen hrudníku a ve vybraných případech CT hrudníku, v závislosti na jejich klinické potřebě.

Dále podstoupí žilní echo-color dopplerovské vyšetření dolních končetin. Kompletní analýza žilních os nebude nutná. Markery NETózy (Cf-DNA. Z plazmy subjektů budou analyzovány MPO-DNA, Cit-H3) a cytokiny IL-6 a IL-1β.

Bude odebrán vzorek slinu (nebo bronchoalveolární tekutina, pokud je to nutné pro diagnosticko-terapeutické účely) a bude hodnocena detekce NET elektronovou mikroskopií.

Bude vyžadován informovaný souhlas.

VÝPOČET VZORKU Velikost vzorku byla definována na základě počtu přijatých pro Covid-19 v měsících březen-duben 2020 a na základě poklesu počtu v aktuálním období.

Předpokládá se, že bude zařazeno 100 subjektů (50 pacientů a 50 kontrol).

STATISTICKÁ ANALÝZA Hypotetická statistická analýza: údaje budou shromažďovány prostřednictvím deskriptivní statistiky. Odhady budou doprovázeny vhodnými 95% intervaly spolehlivosti. Hladina statistické významnosti je stanovena na 5 %. Bude použit statistický program Stata 14.2. Plánovaný test: t-test a Mann-Whitney test. Korelace budou hodnoceny pomocí Pearsonových nebo Spearmanových koeficientů. Dále budou provedeny Kaplan-Meierovy analýzy s využitím Log-Rank testu a Coxovy regrese pro analýzu přežití.