Covid-19: possível papel das armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETSINCOVID)

O processo pelo qual os neutrófilos expelem o DNA junto com várias proteínas para o exterior, formando uma estrutura em rede denominada Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos (NETs) constitui uma morte celular particular que envolve a destruição da membrana nuclear antes da plasmática. Esse processo é chamado de NETosis e difere de outras formas conhecidas de morte celular, como necrose e apoptose.

A morte de neutrófilos por ejeção de NETs (NETosis) foi descrita pela primeira vez em 2004 por Brinkman.

As NETs, ​​como a própria palavra indica, representam uma espécie de rede composta por fibras de DNA, histonas e proteínas derivadas dos grânulos de neutrófilos, cuja principal função é capturar patógenos (principalmente bactérias e fungos). Esse processo está relacionado à imunidade inata .

No entanto, esse processo, se ativado de forma exagerada, implica em dano local ou sistêmico.

O DNA expelido durante esse processo é um DNA de fita dupla, um subtipo dsDNA. O dsDNA, que representa uma fração do DNA disponível na circulação (cell free DNA - cfDNA), tem origem em diversos processos de morte celular, estando, portanto, correlacionado com o grau de dano tecidual. Está presente apenas em pequenas quantidades em indivíduos saudáveis.

É importante sublinhar como durante o processo de NETosis o estado redox celular é alterado, levando a uma produção excessiva de radicais livres de oxigênio (Reactive Oxygen Species, ROS) e à ativação da enzima NADPH oxidase. A formação de NETs e, portanto, o processo de NETosis, foram inicialmente estudados no contexto de infecções bacterianas, mas posteriormente seu papel tornou-se cada vez mais claro em outras condições, como câncer, doenças autoimunes, doenças pulmonares, aterosclerose e doença tromboembólica venosa.

Em particular, a NETose parece desempenhar um papel importante em todas as condições caracterizadas por trombose venosa e arterial, como inúmeras evidências têm confirmado.

A NETosis também foi documentada no nível microvascular, como na vasculite, microangiopatias trombóticas, como a síndrome de Moschowitz.

Os vírus são conhecidos por sua capacidade de escapar da resposta imune do corpo. Recentemente, foi visto que eles também podem atuar como gatilhos de processos de NETosis.

De fato, muitos vírus podem estimular os neutrófilos a produzir NETs. Diferentes respostas dos neutrófilos têm sido observadas, desde a NETose clássica, à produção de agentes antivirais ou mesmo à passagem para apoptose.

TNEs induzidas por vírus (portanto complexos de dsDNA, histonas, proteínas granulares) podem começar a circular de forma descontrolada, levando a uma resposta sistêmica extrema do corpo com a produção de imunocomplexos, citocinas, Interferon I etc.

A NETose parece estar intimamente ligada à resposta inflamatória. Por exemplo, sabe-se que no granulócito neutrofílico a proteína PAD4 está presente no núcleo, descondensando a cromatina e favorecendo a formação dos NETs. Por outro lado, os NETs aumentam em pacientes com síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), conforme observado em estudos sobre lavado broncoalveolar, bem como em pacientes com insuficiência respiratória aguda durante a exacerbação da DPOC.

Fica claro, portanto, que a NETose induzida por vírus atua como uma faca de dois gumes: se por um lado há o aprisionamento mecânico do vírus, por outro a reação inflamatória e imunológica desencadeada pela liberação das NETs pode ser prejudicial em si.

Até o momento, existem poucos dados na literatura sobre o papel dos NETs na infecção por Covid-19, uma infecção viral que pode levar à pneumonia intersticial altamente letal e para a qual não há vacina ou terapia específica atualmente. As formas avançadas de Covid-19 são frequentemente caracterizadas por hiperinflamação ("tempestade de citocinas") com o desenvolvimento de uma condição semelhante à SDRA. Além disso, são cada vez mais frequentes os relatos de fenômenos micro e macrotrombóticos como microangiopatia, embolia pulmonar (que tem levado a um criterioso procedimento de avaliação para profilaxia antitrombótica e/ou coagulação em pacientes com Covid-19).

OBJETIVO DO ESTUDO O objetivo principal do estudo é entender se os TNEs podem estar implicados na resposta ao Covid-19 e por quais mecanismos. Propostas terapêuticas concretas poderiam derivar do conhecimento e aprimoramento dessa forma de imunidade inata.

Para isso, será necessário avaliar a atividade da NETose em pacientes com Covid-19 e avaliar se o curso clínico da doença (agravamento x cura) determina o grau de atividade da NETosi. Portanto, será estudada a associação entre mortalidade por Covid-19/sobrevivência e atividade de TNEs.

Os objetivos secundários dizem respeito à possibilidade de estudar as várias associações entre marcadores NETosis e índices biohumorais de inflamação e entre marcadores NETosi e o aparecimento de trombose venosa periférica ou profunda.

Por fim, será avaliada a possibilidade de o plasma de pacientes com Covid-19 desencadear o processo de NETosis in vitro.

PROCEDIMENTOS PLANEJADOS e INFORMAÇÕES COLETADAS Exame médico: (pressão arterial, frequência cardíaca e SpO2, que permitirá avaliar a relação PaO2 / FiO2 precisa).

Como na prática clínica normal, os pacientes com Covid-19 serão submetidos a amostragem venosa para determinação de hemograma, creatinina, perfil lipídico, PCR, D-dímero, LDH, índices de função hepática e glicemia.

Um histórico médico preciso será elaborado para cada paciente. Os pacientes serão submetidos a: eletrocardiograma e radiografia de tórax e, em casos selecionados, tomografia de tórax, dependendo da necessidade clínica.

Eles também serão submetidos ao exame venoso de eco-color Doppler de membros inferiores. Uma análise completa dos eixos venosos não será necessária. Marcadores de NETosis (Cf-DNA. MPO-DNA, Cit-H3) e as citocinas IL-6 e IL-1β serão analisadas no plasma dos sujeitos.

Amostra de escarro (ou líquido broncoalveolar, se necessário para fins diagnóstico-terapêuticos) será coletada e a detecção de NETs em microscopia eletrônica será avaliada.

O consentimento informado será solicitado.

CÁLCULO DA AMOSTRA O tamanho da amostra foi definido com base no número de internações por Covid-19 nos meses de março a abril de 2020 e na diminuição dos números no período atual.

Espera-se que 100 indivíduos (50 pacientes e 50 controles) sejam inscritos.

ANÁLISE ESTATÍSTICA Análise estatística hipotética: os dados serão coletados por meio de estatística descritiva. As estimativas serão acompanhadas por intervalos de confiança apropriados de 95%. O nível de significância estatística é fixado em 5%. Será utilizado o programa estatístico Stata 14.2. Teste planejado: teste t e teste de Mann-Whitney. As correlações serão avaliadas pelos coeficientes de Pearson ou Spearman. Além disso, análises de Kaplan-Meier serão realizadas com o uso do teste de Log-Rank e regressão de Cox para análise de sobrevivência.