Covid-19: possibile ruolo delle trappole extracellulari dei neutrofili (NETSINCOVID)

Il processo mediante il quale i neutrofili espellono all'esterno il DNA insieme a varie proteine, formando una struttura a rete chiamata Neutrophil Extracellular Traps (NETs) costituisce una particolare morte cellulare che comporta la distruzione della membrana nucleare prima di quella plasmatica. Questo processo è chiamato NETosis e differisce da altre forme note di morte cellulare, come la necrosi e l'apoptosi.

La morte dei neutrofili per espulsione di NET (NETosis) è stata descritta per la prima volta nel 2004 da Brinkman.

I NET, come indicato dalla parola stessa, rappresentano una sorta di rete composta da fibre di DNA, istoni e proteine ​​derivate dai granuli neutrofili, la cui funzione principale è quella di intrappolare i patogeni (principalmente batteri e funghi). Questo processo è legato all'immunità innata .

Tuttavia, questo processo, se attivato in modo esagerato, implica esso stesso un danno locale o sistemico.

Il DNA espulso durante questo processo è un DNA a doppio filamento, un sottotipo dsDNA. Il dsDNA, che rappresenta una frazione del DNA disponibile in circolo (cell free DNA - cfDNA), origina da vari processi di morte cellulare, ed è quindi correlato al grado di danno tissutale. È presente solo in piccole quantità nei soggetti sani.

È importante sottolineare come durante il processo di NETosis lo stato redox cellulare venga alterato, portando ad un'eccessiva produzione di radicali liberi dell'ossigeno (Reactive Oxygen Species, ROS) e all'attivazione dell'enzima NADPH ossidasi. La formazione dei NET, e quindi il processo di NETosis, sono stati inizialmente studiati nel contesto delle infezioni batteriche, ma successivamente il loro ruolo è diventato sempre più chiaro in altre condizioni come il cancro, le malattie autoimmuni, le malattie polmonari, l'aterosclerosi e la malattia tromboembolica venosa.

In particolare, la NETosis sembra svolgere un ruolo importante in tutte le condizioni caratterizzate da trombosi venosa e arteriosa, come numerose evidenze hanno confermato.

La NETosi è stata documentata anche a livello microvascolare, come nella vasculite, nelle microangiopatie trombotiche come la sindrome di Moschowitz.

I virus sono noti per la loro capacità di eludere la risposta immunitaria del corpo. Recentemente si è visto che anch'essi possono agire da inneschi di processi di NETosis.

Infatti, molti virus possono stimolare i neutrofili a produrre NET. Sono state osservate diverse risposte dei neutrofili, dalla classica NETosi, alla produzione di agenti antivirali o addirittura al passaggio all'apoptosi.

I NET indotti da virus (quindi complessi di dsDNA, istoni, proteine ​​granulari) possono cominciare a circolare in modo incontrollato, portando ad una estrema risposta sistemica dell'organismo con la produzione di immunocomplessi, citochine, Interferone I ecc.

La NETosis sembra essere strettamente collegata alla risposta infiammatoria. Ad esempio, è noto che nei granulociti neutrofili è presente nel nucleo la proteina PAD4, che decondensa la cromatina e favorisce la formazione dei NET. D'altra parte, i NET aumentano nei pazienti con sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) come osservato negli studi sul liquido di lavaggio broncoalveolare, così come nei pazienti con insufficienza respiratoria acuta durante l'esacerbazione della BPCO.

È chiaro quindi che la NETosi indotta da virus agisce come un'arma a doppio taglio: se da un lato c'è l'intrappolamento meccanico del virus, dall'altro la reazione infiammatoria e immunologica innescata dal rilascio dei NET può essere essa stessa dannosa.

Ad oggi sono pochi i dati in letteratura sul ruolo dei NET nell'infezione da Covid-19, un'infezione virale che può portare a polmonite interstiziale altamente letale e per la quale ad oggi non esiste un vaccino o una terapia specifica. Le forme avanzate di Covid-19 sono spesso caratterizzate da iperinfiammazione ("tempesta di citochine") con lo sviluppo di una condizione simile all'ARDS. Inoltre, sono sempre più frequenti le segnalazioni di micro e macro fenomeni trombotici quali microangiopatia, embolia polmonare (che ha portato ad un attento iter valutativo per la profilassi antitrombotica e/o coagulativa nei pazienti Covid-19).

OBIETTIVO DELLO STUDIO L'obiettivo primario dello studio è capire se i NET possono essere implicati nella risposta al Covid-19 e con quali meccanismi. Dalla conoscenza e dalla valorizzazione di questa forma di immunità innata potrebbero derivare concrete proposte terapeutiche.

Per fare questo, sarà necessario valutare l'attività di NETosis nei pazienti Covid-19 e valutare se il decorso clinico della malattia (peggioramento vs guarigione) determina il grado di attività di NETosi. Verrà quindi studiata l'associazione tra mortalità da Covid-19/sopravvivenza e attività dei NET.

Obiettivi secondari riguardano la possibilità di studiare le varie associazioni tra marcatori di NETosi e indici bioumorali di infiammazione e tra marcatori di NETosi e insorgenza di trombosi venosa periferica o profonda.

Verrà infine valutata la possibilità che il plasma di pazienti Covid-19 possa innescare il processo di NETosis in vitro.

PROCEDURE PREVISTE e INFORMAZIONI RACCOLTE Visita medica: (pressione arteriosa, frequenza cardiaca e SpO2, che permetterà di valutare l'esatto rapporto PaO2/FiO2).

Come nella normale pratica clinica, i pazienti Covid-19 saranno sottoposti a prelievo venoso per la determinazione di emocromo, creatinina, profilo lipidico, PCR, D-dimero, LDH, indici di funzionalità epatica e glicemia.

Per ogni soggetto verrà redatta una precisa anamnesi. I pazienti verranno sottoposti a: elettrocardiogramma e radiografia del torace e, in casi selezionati, TC del torace, a seconda delle necessità cliniche.

Verranno inoltre sottoposti ad esame venoso eco-color Doppler degli arti inferiori. Non sarà necessaria un'analisi completa degli assi venosi. Marcatori di NETosis (Cf-DNA. MPO-DNA, Cit-H3) e le citochine IL-6 e IL-1β saranno analizzate dal plasma dei soggetti.

Verrà prelevato un campione di sputo (o liquido broncoalveolare se necessario per scopi diagnostico-terapeutici) e verrà valutata la rilevazione di NET al microscopio elettronico.

Verrà richiesto il consenso informato.

CALCOLO DEL CAMPIONE La dimensione del campione è stata definita sulla base del numero di ricoveri per Covid-19 nei mesi di marzo-aprile 2020 e sulla diminuzione dei numeri nel periodo in corso.

Si prevede l'arruolamento di 100 soggetti (50 pazienti e 50 controlli).

ANALISI STATISTICA Analisi statistica ipotetica: i dati saranno raccolti attraverso statistiche descrittive. Le stime saranno accompagnate da opportuni intervalli di confidenza al 95%. Il livello di significatività statistica è fissato al 5%. Verrà utilizzato il programma statistico Stata 14.2. Test programmato: test t e test di Mann-Whitney. Le correlazioni saranno valutate attraverso i coefficienti di Pearson o Spearman. Inoltre, verranno effettuate analisi di Kaplan-Meier con l'utilizzo del Log-Rank test e della regressione di Cox per l'analisi di sopravvivenza.