Covid-19 : rôle possible des pièges extracellulaires de neutrophiles (NETSINCOVID)

Le processus par lequel les neutrophiles expulsent l'ADN avec diverses protéines vers l'extérieur, formant une structure en réseau appelée Neutrophil Extracellular Traps (NETs) constitue une mort cellulaire particulière qui implique la destruction de la membrane nucléaire avant celle plasmatique. Ce processus est appelé NETosis et diffère des autres formes connues de mort cellulaire, telles que la nécrose et l'apoptose.

La mort des neutrophiles par éjection de NET (NETosis) a été décrite pour la première fois en 2004 par Brinkman.

Les TNE, comme l'indique le mot lui-même, représentent une sorte de réseau composé de fibres d'ADN, d'histones et de protéines dérivées des granules de neutrophiles, dont la fonction principale est de piéger les agents pathogènes (principalement des bactéries et des champignons). Ce processus est lié à l'immunité innée. .

Cependant, ce processus, s'il est activé de manière exagérée, implique lui-même des dommages locaux ou systémiques.

L'ADN expulsé au cours de ce processus est un ADN double brin, un sous-type d'ADNdb. Le dsDNA, qui représente une fraction de l'ADN disponible dans la circulation (cell free DNA - cfDNA), est issu de divers processus de mort cellulaire, et est donc corrélé au degré d'endommagement des tissus. Il n'est présent qu'en faible quantité chez les sujets sains.

Il est important de souligner comment, au cours du processus de NETosis, l'état redox cellulaire est altéré, conduisant à une production excessive de radicaux libres d'oxygène (Reactive Oxygen Species, ROS) et à l'activation de l'enzyme NADPH oxydase. La formation des NET, et donc le processus de NETosis, ont d'abord été étudiés dans le cadre d'infections bactériennes, mais par la suite leur rôle est devenu de plus en plus clair dans d'autres affections telles que le cancer, les maladies auto-immunes, les maladies pulmonaires, l'athérosclérose et la maladie thromboembolique veineuse.

En particulier, la NETosis semble jouer un rôle important dans toutes les conditions caractérisées par une thrombose veineuse et artérielle, comme de nombreuses preuves l'ont confirmé.

La NETosis a également été documentée au niveau microvasculaire, comme dans les vascularites, les microangiopathies thrombotiques telles que le syndrome de Moschowitz.

Les virus sont connus pour leur capacité à échapper à la réponse immunitaire de l'organisme. Récemment, on a vu qu'ils pouvaient eux aussi agir comme déclencheurs des processus NETosis.

En fait, de nombreux virus peuvent stimuler les neutrophiles à produire des TNE. Différentes réponses des neutrophiles ont été observées, de la NETosis classique, à la production d'agents antiviraux ou encore au passage à l'apoptose.

Les TNE induites par des virus (donc des complexes d'ADNdb, d'histones, de protéines granulaires) peuvent commencer à circuler de manière incontrôlée, entraînant une réponse systémique extrême de l'organisme avec la production de complexes immuns, de cytokines, d'interféron I, etc.

La NETosis semble être étroitement liée à la réponse inflammatoire. Par exemple, on sait que dans le granulocyte neutrophile la protéine PAD4 est présente dans le noyau, elle décondense la chromatine et favorise la formation des NET. D'autre part, les TNE augmentent chez les patients atteints du syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) comme observé dans les études sur le liquide de lavage bronchoalvéolaire, ainsi que chez les patients présentant une insuffisance respiratoire aiguë au cours de l'exacerbation de la BPCO.

Il est donc clair que la NETosis induite par le virus agit comme une épée à double tranchant : si d'un côté il y a le piégeage mécanique du virus, de l'autre la réaction inflammatoire et immunologique déclenchée par la libération des NET peut être elle-même nocive.

Il existe à ce jour peu de données dans la littérature sur le rôle des TNE dans l'infection au Covid-19, une infection virale pouvant entraîner une pneumonie interstitielle hautement létale et pour laquelle il n'existe aujourd'hui ni vaccin ni traitement spécifique. Les formes avancées de Covid-19 sont souvent caractérisées par une hyperinflammation (« tempête de cytokines ») avec développement d'une affection de type SDRA. Par ailleurs, les déclarations de phénomènes micro et macro thrombotiques tels que la microangiopathie, l'embolie pulmonaire (qui a conduit à une procédure d'évaluation minutieuse pour la prophylaxie antithrombotique et/ou la coagulation chez les patients Covid-19) sont de plus en plus fréquentes.

OBJECTIF DE L'ETUDE L'objectif premier de l'étude est de comprendre si les TNE peuvent être impliquées dans la réponse au Covid-19 et par quels mécanismes. Des propositions thérapeutiques concrètes pourraient découler de la connaissance et de l'amélioration de cette forme d'immunité innée.

Pour ce faire, il faudra évaluer l'activité de NETosis chez les patients Covid-19 et évaluer si l'évolution clinique de la maladie (aggravation vs guérison) détermine le degré d'activité de NETosi. Par conséquent, l'association entre la mortalité par Covid-19/survie et l'activité des TNE sera étudiée.

Les objectifs secondaires concernent la possibilité d'étudier les différentes associations entre les marqueurs NETosis et les indices biohumoraux de l'inflammation et entre les marqueurs NETosi et la survenue d'une thrombose veineuse périphérique ou profonde.

Enfin, la possibilité que le plasma de patients Covid-19 puisse déclencher le processus NETosis in vitro sera évaluée.

PROCÉDURES PRÉVUES et INFORMATIONS RECUEILLIES Examen médical : (tension artérielle, fréquence cardiaque et SpO2, qui permettront d'évaluer précisément le rapport PaO2/FiO2).

Comme dans la pratique clinique normale, les patients Covid-19 subiront un prélèvement veineux pour la détermination de la numération globulaire, de la créatinine, du profil lipidique, de la PCR, des D-dimères, de la LDH, des indices de la fonction hépatique et de la glycémie.

Un historique médical précis sera établi pour chaque sujet. Les patients subiront : un électrocardiogramme et une radiographie pulmonaire et, dans certains cas, une tomodensitométrie pulmonaire, en fonction de leurs besoins cliniques.

Ils subiront également un examen veineux des membres inférieurs par écho-Doppler couleur. Une analyse complète des axes veineux ne sera pas nécessaire. Marqueurs NETosis (Cf-DNA. MPO-DNA, Cit-H3) et les cytokines IL-6 et IL-1β seront analysés à partir du plasma des sujets.

Un échantillon de crachat (ou de liquide bronchoalvéolaire si nécessaire à des fins diagnostiques et thérapeutiques) sera prélevé et la détection des TNE au microscope électronique sera évaluée.

Un consentement éclairé sera demandé.

CALCUL DE L'ÉCHANTILLON La taille de l'échantillon a été définie sur la base du nombre d'admissions pour Covid-19 sur les mois de mars-avril 2020 et sur la diminution des effectifs sur la période en cours.

100 sujets (50 patients et 50 témoins) devraient être inscrits.

ANALYSE STATISTIQUE Analyse statistique hypothétique : les données seront recueillies au moyen de statistiques descriptives. Les estimations seront accompagnées d'intervalles de confiance appropriés à 95 %. Le niveau de signification statistique est fixé à 5 %. Le programme statistique Stata 14.2 sera utilisé. Test prévu : test t et test de Mann-Whitney. Les corrélations seront évaluées à l'aide des coefficients de Pearson ou de Spearman. De plus, des analyses de Kaplan-Meier seront effectuées avec l'utilisation du test Log-Rank et de la régression de Cox pour l'analyse de survie.