Covid-19: posible papel de las trampas extracelulares de neutrófilos (NETSINCOVID)

El proceso por el cual los neutrófilos expulsan el ADN junto con diversas proteínas al exterior, formando una estructura de red denominada Trampas Extracelulares de Neutrófilos (NETs) constituye una muerte celular particular que implica la destrucción de la membrana nuclear antes que la plasmática. Este proceso se denomina NETosis y difiere de otras formas conocidas de muerte celular, como la necrosis y la apoptosis.

La muerte de neutrófilos por eyección de NET (NETosis) fue descrita por primera vez en 2004 por Brinkman.

Los NET, como su propia palabra lo indica, representan una especie de red compuesta por fibras de ADN, histonas y proteínas derivadas de los gránulos de neutrófilos, cuya función principal es atrapar patógenos (principalmente bacterias y hongos). Este proceso está relacionado con la inmunidad innata. .

Sin embargo, este proceso, si se activa de manera exagerada, implica en sí mismo un daño local o sistémico.

El ADN expulsado durante este proceso es un ADN de doble cadena, un subtipo de dsDNA. El dsDNA, que representa una fracción del ADN disponible en la circulación (cell free DNA - cfDNA), se origina en varios procesos de muerte celular y, por lo tanto, se correlaciona con el grado de daño tisular. Está presente sólo en pequeñas cantidades en sujetos sanos.

Es importante subrayar cómo durante el proceso de NETosis se altera el estado redox celular, dando lugar a un exceso de producción de radicales libres de oxígeno (Reactive Oxygen Species, ROS) y a la activación de la enzima NADPH oxidasa. La formación de NET y, por tanto, el proceso de NETosis, se estudió inicialmente en el contexto de infecciones bacterianas, pero posteriormente su papel se hizo cada vez más claro en otras enfermedades como el cáncer, las enfermedades autoinmunes, las enfermedades pulmonares, la aterosclerosis y la enfermedad tromboembólica venosa.

En particular, la NETosis parece jugar un papel importante en todas las condiciones caracterizadas por trombosis venosa y arterial, como lo han confirmado numerosas evidencias.

También se ha documentado NETosis a nivel microvascular, como en vasculitis, microangiopatías trombóticas como el síndrome de Moschowitz.

Los virus son conocidos por su capacidad para evadir la respuesta inmune del cuerpo. Recientemente se ha visto que también pueden actuar como desencadenantes de procesos de NETosis.

De hecho, muchos virus pueden estimular a los neutrófilos para que produzcan NET. Se han visto diferentes respuestas de los neutrófilos, desde la NETosis clásica, hasta la producción de agentes antivirales o incluso el paso a la apoptosis.

Los NET inducidos por virus (por lo tanto, complejos de dsDNA, histonas, proteínas granulares) pueden comenzar a circular de forma descontrolada, lo que lleva a una respuesta sistémica extrema del cuerpo con la producción de inmunocomplejos, citoquinas, Interferón I, etc.

La NETosis parece estar estrechamente relacionada con la respuesta inflamatoria. Por ejemplo, se sabe que en el granulocitos neutrófilos la proteína PAD4 está presente en el núcleo, descondensa la cromatina y favorece la formación de los NET. Por otro lado, los TNE aumentan en pacientes con síndrome de distrés respiratorio agudo (SDRA), como se observa en estudios sobre líquido de lavado broncoalveolar, así como en pacientes con insuficiencia respiratoria aguda durante la exacerbación de la EPOC.

Por tanto, está claro que la NETosis inducida por virus actúa como un arma de doble filo: si por un lado existe el atrapamiento mecánico del virus, por otro lado la reacción inflamatoria e inmunológica desencadenada por la liberación de los TNE puede ser perjudicial en sí misma.

Hasta la fecha, hay pocos datos en la literatura sobre el papel de los NET en la infección por Covid-19, una infección viral que puede conducir a una neumonía intersticial altamente letal y para la cual no existe una vacuna o terapia específica en la actualidad. Las formas avanzadas de Covid-19 a menudo se caracterizan por hiperinflamación ("tormenta de citoquinas") con el desarrollo de una condición similar a ARDS. Además, cada vez son más frecuentes los reportes de fenómenos micro y macro trombóticos como microangiopatía, embolismo pulmonar (lo que ha llevado a un cuidadoso procedimiento de evaluación para profilaxis antitrombótica y/o coagulación en pacientes con Covid-19).

OBJETIVO DEL ESTUDIO El objetivo principal del estudio es comprender si los NET pueden estar implicados en la respuesta a Covid-19 y por qué mecanismos. Del conocimiento y potenciación de esta forma de inmunidad innata podrían derivarse propuestas terapéuticas concretas.

Para ello, será necesario evaluar la actividad de NETosis en pacientes con Covid-19 y evaluar si el curso clínico de la enfermedad (empeoramiento vs curación) determina el grado de actividad de NETosi. Por tanto, se estudiará la asociación entre la mortalidad por Covid-19/supervivencia y la actividad de los TNE.

Los objetivos secundarios se refieren a la posibilidad de estudiar las diversas asociaciones entre los marcadores de NETosis y los índices biohumorales de inflamación y entre los marcadores de NETosi y la aparición de trombosis venosa periférica o profunda.

Finalmente, se evaluará la posibilidad de que el plasma de pacientes con Covid-19 pueda desencadenar el proceso de NETosis in vitro.

PROCEDIMIENTOS PLANIFICADOS e INFORMACIÓN RECOGIDA Examen médico: (presión arterial, frecuencia cardíaca y SpO2, que permitirán evaluar la relación precisa PaO2/FiO2).

Como en la práctica clínica habitual, a los pacientes con Covid-19 se les realizará una toma de muestras venosas para la determinación de hemograma, creatinina, perfil lipídico, PCR, dímero D, LDH, índices de función hepática y glucemia.

Se elaborará una historia clínica precisa de cada sujeto. A los pacientes se les realizará: electrocardiograma y radiografía de tórax y, en casos seleccionados, tomografía computarizada de tórax, según su necesidad clínica.

También se les realizará un examen eco-doppler venoso de miembros inferiores. No será necesario un análisis completo de los ejes venosos. Marcadores de NETosis (Cf-DNA. MPO-DNA, Cit-H3) y las citocinas IL-6 e IL-1β se analizarán del plasma de los sujetos.

Se recogerá muestra de saliva (o líquido broncoalveolar si es necesario con fines diagnóstico-terapéuticos) y se valorará la detección de TNE por microscopía electrónica.

Se solicitará el consentimiento informado.

CÁLCULO DE LA MUESTRA El tamaño de la muestra se definió con base en el número de ingresos por Covid-19 en los meses de marzo-abril de 2020 y en la disminución de números en el período actual.

Se espera que se inscriban 100 sujetos (50 pacientes y 50 controles).

ANÁLISIS ESTADÍSTICO Análisis estadístico hipotético: los datos se recogerán mediante estadística descriptiva. Las estimaciones irán acompañadas de intervalos de confianza del 95% apropiados. El nivel de significación estadística se fija en el 5%. Se utilizará el programa estadístico Stata 14.2. Prueba planificada: prueba t y prueba de Mann-Whitney. Las correlaciones se evaluarán mediante coeficientes de Pearson o Spearman. Además, los análisis de Kaplan-Meier se llevarán a cabo con el uso de la prueba Log-Rank y la regresión de Cox para el análisis de supervivencia.