Covid-19: możliwa rola zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NETSINCOVID)

Proces, w którym neutrofile wyrzucają DNA wraz z różnymi białkami na zewnątrz, tworząc strukturę sieciową zwaną Pułapkami Zewnątrzkomórkowymi Neutrofili (NET), stanowi szczególną śmierć komórki, która polega na zniszczeniu błony jądrowej przed błoną plazmatyczną. Proces ten nazywa się NETosis i różni się od innych znanych form śmierci komórki, takich jak martwica i apoptoza.

Śmierć neutrofili przez wyrzut NET (NETosis) została po raz pierwszy opisana w 2004 roku przez Brinkmana.

NET, jak wskazuje samo słowo, stanowią rodzaj sieci złożonej z włókien DNA, histonów i białek pochodzących z granulek neutrofili, których główną funkcją jest wychwytywanie patogenów (głównie bakterii i grzybów). Proces ten jest związany z odpornością wrodzoną .

Jednak proces ten, jeśli zostanie aktywowany w przesadny sposób, pociąga za sobą lokalne lub ogólnoustrojowe uszkodzenia.

DNA wydalony podczas tego procesu jest dwuniciowym DNA, podtypem dsDNA. dsDNA, który reprezentuje frakcję DNA dostępnego w krwioobiegu (cell free DNA - cfDNA), pochodzi z różnych procesów śmierci komórki, a zatem jest skorelowany ze stopniem uszkodzenia tkanki. Występuje tylko w niewielkich ilościach u zdrowych osób.

Należy podkreślić, w jaki sposób podczas procesu NETosis zmienia się stan redoks komórki, co prowadzi do nadmiernej produkcji wolnych rodników tlenowych (Reactive Oxygen Species, ROS) oraz do aktywacji enzymu oksydazy NADPH. Powstawanie NET, a tym samym proces NETosis, początkowo badano w kontekście infekcji bakteryjnych, ale później ich rola stawała się coraz bardziej jasna w innych stanach, takich jak rak, choroby autoimmunologiczne, choroby płuc, miażdżyca tętnic i żylna choroba zakrzepowo-zatorowa.

W szczególności NETosis wydaje się odgrywać ważną rolę we wszystkich stanach charakteryzujących się zakrzepicą żylną i tętniczą, co potwierdzają liczne dowody.

NETosis udokumentowano również na poziomie mikrokrążenia, na przykład w zapaleniu naczyń, mikroangiopatiach zakrzepowych, takich jak zespół Moschowitza.

Wirusy są znane ze swojej zdolności do unikania odpowiedzi immunologicznej organizmu. Ostatnio zaobserwowano, że one również mogą działać jako wyzwalacze procesów NETosis.

W rzeczywistości wiele wirusów może stymulować neutrofile do produkcji NET. Zaobserwowano różne reakcje neutrofili, od klasycznej NETosis, do wytwarzania środków przeciwwirusowych, a nawet do przejścia w stan apoptozy.

Indukowane przez wirusy NET (a więc kompleksy dsDNA, histony, białka ziarniste) mogą zacząć krążyć w niekontrolowany sposób, prowadząc do skrajnej ogólnoustrojowej odpowiedzi organizmu z produkcją kompleksów immunologicznych, cytokin, interferonu I itp.

Wydaje się, że NETosis jest ściśle związana z odpowiedzią zapalną. Wiadomo na przykład, że w granulocytach obojętnochłonnych białko PAD4 jest obecne w jądrze, powoduje dekondensację chromatyny i sprzyja powstawaniu NET. Z drugiej strony, NET zwiększają się u pacjentów z zespołem ostrej niewydolności oddechowej (ARDS), co zaobserwowano w badaniach płynu z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych, a także u pacjentów z ostrą niewydolnością oddechową w okresie zaostrzenia POChP.

Jest zatem jasne, że wywołana przez wirusy NETosis działa jak miecz obosieczny: jeśli z jednej strony wirus zostaje uwięziony mechanicznie, z drugiej reakcja zapalna i immunologiczna wywołana uwolnieniem NET może być sama w sobie szkodliwa.

Do chwili obecnej w literaturze istnieje niewiele danych na temat roli NET w zakażeniu Covid-19, infekcją wirusową, która może prowadzić do wysoce śmiertelnego śródmiąższowego zapalenia płuc i na którą nie ma obecnie szczepionki ani specyficznej terapii. Zaawansowane formy Covid-19 często charakteryzują się hiperzapaleniem („burzą cytokinową”) z rozwojem stanu podobnego do ARDS. Ponadto coraz częstsze są doniesienia o zjawiskach mikro- i makrozakrzepowych, takich jak mikroangiopatia, zatorowość płucna (co doprowadziło do starannej procedury oceny profilaktyki przeciwzakrzepowej i / lub krzepnięcia u pacjentów z Covid-19).

CEL BADANIA Głównym celem badania jest zrozumienie, czy NET mogą być zaangażowane w odpowiedź na Covid-19 i za pomocą jakich mechanizmów. Konkretne propozycje terapeutyczne mogłyby wynikać ze znajomości i wzmocnienia tej formy odporności wrodzonej.

W tym celu konieczna będzie ocena aktywności NETosis u pacjentów z Covid-19 oraz ocena, czy przebieg kliniczny choroby (pogorszenie vs gojenie) determinuje stopień aktywności NETosi. Dlatego zbadany zostanie związek między śmiertelnością z powodu Covid-19/przeżycia a aktywnością NET.

Cele drugorzędne dotyczą możliwości zbadania różnych związków między markerami NETosis a biohumoralnymi wskaźnikami stanu zapalnego oraz między markerami NETosi a początkiem zakrzepicy żył obwodowych lub głębokich.

Na koniec oceniona zostanie możliwość, że osocze od pacjentów z Covid-19 może wywołać proces NETosis in vitro.

PLANOWANE PROCEDURY i ZBIERANE INFORMACJE Badanie lekarskie: (ciśnienie krwi, tętno i SpO2, które pozwolą na dokładną ocenę stosunku PaO2 / FiO2).

Podobnie jak w normalnej praktyce klinicznej, od pacjentów z Covid-19 zostaną pobrane próbki żylne w celu oznaczenia morfologii krwi, kreatyniny, profilu lipidowego, PCR, D-dimerów, LDH, wskaźników czynności wątroby i glukozy we krwi.

Dla każdego pacjenta zostanie sporządzona dokładna historia medyczna. Pacjenci zostaną poddani: elektrokardiogramowi i prześwietleniu klatki piersiowej oraz w wybranych przypadkach tomografii komputerowej klatki piersiowej, w zależności od potrzeb klinicznych.

Zostaną także poddani badaniu kończyn dolnych metodą echa-kolorowego Dopplera żylnego. Pełna analiza osi żylnych nie będzie konieczna. Markery NETosis (Cf-DNA. MPO-DNA, Cit-H3) oraz cytokiny IL-6 i IL-1β będą analizowane z osocza osobników.

Zostanie pobrana próbka plwociny (lub płynu oskrzelowo-pęcherzykowego, jeśli jest to konieczne do celów diagnostyczno-terapeutycznych) i oceniona zostanie detekcja NET pod mikroskopem elektronowym.

Świadoma zgoda zostanie poproszona.

OBLICZANIE PRÓBY Liczebność próby została określona na podstawie liczby przyjęć z powodu Covid-19 w miesiącach marzec-kwiecień 2020 r. oraz spadku liczebności w bieżącym okresie.

Oczekuje się, że zapisanych zostanie 100 pacjentów (50 pacjentów i 50 osób z grupy kontrolnej).

ANALIZA STATYSTYCZNA Hipotetyczna analiza statystyczna: dane będą zbierane za pomocą statystyk opisowych. Oszacowaniom towarzyszyć będą odpowiednie 95% przedziały ufności. Poziom istotności statystycznej ustalono na 5%. Wykorzystany zostanie program statystyczny Stata 14.2. Planowany test: test t i test Manna-Whitneya. Korelacje zostaną ocenione za pomocą współczynników Pearsona lub Spearmana. Ponadto przeprowadzone zostaną analizy Kaplana-Meiera z wykorzystaniem testu Log-Rank oraz regresji Coxa do analizy przeżycia.