Buněčná signalizace, reinervace a metabolismus u Kennedyho choroby a amyotrofické laterální sklerózy (ALS) (CERMALS)

U amyotrofické laterální sklerózy (ALS) je ztráta funkčních motorických neuronů zpočátku kompenzována kolaterální reinervací, ale jak onemocnění postupuje, kompenzace obvykle selhává, což vede k progresivní svalové slabosti. Naopak u dlouhodobě přežívajících ALS pomalý funkční pokles koreluje s jejich schopností udržet úspěšnou kompenzační odpověď na denervaci v průběhu času. Molekulární mechanismy, kterými se kompenzační reinervace, klíčový proces pro funkci a přežití, udržuje v průběhu času, zbývá objasnit. Již dříve jsme ukázali, že svalové faktory se mohou podílet na udržování svalové inervace a funkce u dlouhodobě přežívajících ALS (Bruneteau et al., 2013). Energetický metabolismus a modifikace homeostázy glukózy také ovlivňují klinický průběh onemocnění, ale mechanismy, kterými přispívají k progresi ALS, nejsou známy. Inzulínové signalizační kaskády sdílejí mnoho společných kroků se signálními cestami inzulinu podobného růstového faktoru-1 (IGF-1) a spojují udržování svalové hmoty s glukózovým a energetickým metabolismem, které jsou oba spojeny s progresí ALS. Naší pracovní hypotézou je, že inzulinové signální dráhy hrají hlavní roli při udržování kolaterální reinervace a svalové funkce u ALS. Abychom tuto hypotézu podpořili, budeme kvantifikovat inervaci ve svalových vzorcích získaných od pacientů s ALS a korelovat tyto výsledky s úrovní aktivace hlavních signálních drah inzulínu a expresí klíčových determinant metabolismu glukózy. Tato data budou analyzována společně s hodnocením motorické funkce a ztráty motorických neuronů v průběhu času, abychom pochopili, jak inzulínová signalizace a homeostáza glukózy ovlivňují progresi onemocnění. Aby bylo možné dešifrovat, jak se metabolismus energie a glukózy podílí na zachování vysoké úrovně kolaterální reinervace v průběhu času, výsledky získané u pacientů s ALS budou porovnány s výsledky normálních subjektů podobného věku a pacientů se spinální a bulbární svalovou atrofií (SBMA).

HODNOCENÍ PACIENTŮ

1. Klinické hodnocení

   • Charakteristika pacientů
   • Charakteristiky pacienta budou přezkoumány v době zařazení: osobní nebo rodinná anamnéza zdravotních stavů, věk při nástupu, lokalizace nástupu (končetina nebo bulbární), souběžné léky včetně riluzolu.
   • Hodnocení onemocnění bude provedeno na začátku, 3 měsíce, 6 měsíců a 12 měsíců:
   • Funkční porucha bude posuzována pomocí revidované škály funkčního hodnocení ALS (ALSFRS-R), 12položkové škály, která hodnotí výkon činností každodenního života. Příznaky a symptomy se pohybují od 4 (normální funkce) do 0 (neschopnost pokusit se o úkol) (Cedarbaum et al., 1999). Je uvedeno dvanáct funkcí, včetně: řeči, slinění a polykání pro bulbární postižení; psaní, krmení, oblékání, otáčení v posteli, chůze a lezení po schodech pro postižení horních a dolních končetin; dýchací funkce.
   • Svalová síla bude měřena na 28 svalech manuálním svalovým testováním podle systému hodnocení Medical Research Council.

2. Laboratorní testy

   • Rutinní biologické testy, včetně počtu krevních destiček a koagulačního testu, budou provedeny na začátku
   • U všech pacientů bude v době zařazení proveden genetický screening všech hlavních genů spojených s ALS (včetně dosavadních genů C9ORF72, SOD1, TARDBP, FUS, UBQLN2, TBK1 a jakéhokoli nového hlavního genu spojeného s ALS, který by mohl být objeven) .
   • Respirační funkce bude hodnocena na začátku, M6 a M12 jako součást rutinního kontrolního postupu v ALS centru, včetně vitální kapacity vyjádřené jako procento předpokládané normální vitální kapacity, analýza arteriálních krevních plynů pro stanovení parciálního tlaku v tepně kyslíku a oxidu uhličitého a noční pulzní oxymetrie (saturace oxyhemoglobinu).
3. Postup povrchového EMG a měření indexu počtu motorických jednotek (MUNIX) Hodnocení neuromuskulární funkce povrchovým EMG bude provedeno u všech pacientů na začátku studie. Standardizovaný EMG protokol bude zahrnovat studie vedení motorického nervu na horních a dolních končetinách a studie opakované nervové stimulace pro hodnocení neuromuskulárního přenosu na míšním přídatném nervu, axilárním nervu, ulnárním nervu a radiálním nervu obou horních končetin. Měření MUNIX bude provedeno na deltovém svalu a bicepsu brachii na začátku, 3 měsíce, 6 měsíců a 12 měsíců.
4. Hodnocení nutričního stavu a celkového metabolického profilu

Posouzení nutričního stavu a obecného metabolického profilu bude provedeno na začátku pro dvě skupiny pacientů a bude zahrnovat:

• Sběr dat pro hmotnost, výšku, stanovení BMI, obvod pasu a boků (výpočet poměru pas/boky), příjem živin
• Měření složení těla celým tělem Duální rentgenová absorptiometrie (DEXA)
• Stanovení klidového energetického výdeje (nepřímá kalorimetrie)
• Hodnocení sekrece inzulínu a inzulínové rezistence s měřením hladin glukózy a inzulínu před a 30 minut po požití standardizovaného testu tekutého jídla. Inzulinová rezistence a sekrece inzulinu bude hodnocena výpočtem HOMA-IR (index inzulinové rezistence) a sekrece inzulinu bude hodnocena výpočtem HOMA-B (index inzulinové sekrece) a inzulinogenní index.
• Stanovení sérových koncentrací složek osy IGF-1.

POSTUP SVALOVÉ BIOPIE MOTOR-BODU Všem pacientům budou vzorky svalů odebrány z deltového svalu otevřenou biopsií v lokální anestezii všem pacientům. Oblast obsahující NMJ bude určena malým škubnutím vyvolaným špičkou skalpelu na povrchu svalových svazků. U zdravých kontrolních subjektů budou bioptické vzorky deltového svalu získány během operace ramene pro onemocnění kloubů nebo kostí.

Přítomnost NMJ na podélném proužku bioptického vzorku bude potvrzena pomocí klasické Koelleovy metody odhalující aktivitu cholinesterázy (Koelle a Friedenwald, 1949). Každý bioptický vzorek bude rozdělen na několik svalových fragmentů. Pro konfokální zobrazovací studii morfologie NMJ budou vzorky svalů fixovány ve 4% paraformaldehydu. Pro studium ultrastruktury NMJ elektronovou mikroskopií budou tenké proužky svaloviny ze vzorku fixovány ve směsi paraformaldehydu 2 % a glutaraldehydu 2,5 %. Několik svalových fragmentů bude čerstvě zmrazeno v isopentanu pro histologické, biochemické a molekulární studie.